食品微生物检测技术和方法研究进展

秦俊莲1,2，徐宁宁2

(1.广东中测食品化妆品安全评价中心有限公司，广东中山 528437;

2.广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东广州 510070)

摘 要：随着我国经济发展和社会进步，食品安全质量已经成为当今备受关注的社会问题之一。食品微生物检测是食品安全与质量评价的重要技术手段之一，本文对食品微生物检测的方法进行了概述，包括传统检测方法、改进后的培养检测法、代谢技术法、生物传感器法、免疫学技术法、分子生物学方法等，以期为食品微生物监测提供参考。

关键词：食品安全;食品微生物;检测技术;方法

随着国际食品经济和贸易的发展，食品安全问题受到社会的广泛关注。食源性微生物引起的食品安全风险已成为全球性问题。国家食品安全调查数据显示，2010年以来致病微生物导致的食物中毒事件数量一直多于化学性危害和有毒动植物造成的危害。在病因明确的食源性疾病暴发事件中，由微生物因素引起的发病人数最多，占总数的43.88%。据中国疾病预防控制中心统计数据显示，近十年，我国由食源性病原微生物引起的食品安全事故比例高达60%以上[1]。食源性疾病逐渐成为当今世界最突出的食品安全问题，而微生物污染存在于食品的加工、生产和流通等各个环节。微生物检测在食品安全评价及质量监控方面发挥着重要作用，限定食品中微生物存在量的阈值，建立完善的微生物检测体系是保障食品安全的重要措施[2]。

食品微生物检测主要包括菌落总数、大肠菌群和致病菌3个方面的检测。检测人员对食品进行特殊处理，在特定环境下进行培养，测定待测指标。除益生菌以外，一般而言，食品中菌落总数越多，表示该食品受微生物污染程度越严重，食品安全性越差。大肠菌群包含肠杆菌科的柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯菌属，属于能产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌类，这些细菌寄居于人或者温血动物肠道内，可随大便排出寄主体外，食物受粪便污染的程度用大肠菌群系数表示。致病菌是指可导致人们产生疾病的细菌类群，根据现行有效的食品安全国家标准，致病菌主要指肠道致病菌和致病性球菌，主要包括沙门氏菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等，食品安全标准要求食品中致病菌不得检出。在实际检测工作中，如大肠菌群检测结果呈阳性，则该食品受到致病菌污染可能性增加，可进行致病菌指标检测[3]，另外根据长期检测经验和特定产品类型也可直接进行某项致病菌检测，如水产品的副溶血性弧菌。根据检测需要，运用微生物学的理论与技术，检测食品中可能存在的微生物的种类、数量等，以判别食品是否符合国家食品安全质量标准的过程为食品微生物检测，其主要方法如下。

1 传统检测方法

传统检测方法是基于微生物形态学和培养特性为评价标准的方法。长期以来，传统食品微生物检测一直遵循增菌培养、分离纯化、形态学和生化、血清学鉴定的传统方法。传统检测方法准确性和灵敏度较高，但检测流程繁杂、检测时间长、准备和收尾工作繁重、效率不高等问题突出[2]，尤其是部分类别的食品保质期短，采用传统检测方法，严重影响和制约了食品在市场上的销售及流通。此外，传统检测方法无法对难培养或不可培养的微生物进行检测。随着仪器自动化、分子生物学等分析技术的发展，开发、应用并推广准确高效的食品微生物检测方法是食品安全检测的重要目标之一。

2 改进后的培养检测法

基于传统检测方法，对培养基成分进行改良，在培养过程中加入指示剂、显色剂、抑菌剂、荧光物质等来完善培养，可提高培养基的特异性增菌或分离效果。对培养基的使用便利性进行升级改进，如快速检测纸片、集成化生化鉴定试剂条及仪器自动化技术在食品微生物检测方面具有显著优点。

3 代谢技术法

在微生物生长过程中，可根据代谢产物变化、生物电阻抗等特征开展微生物检测工作，达到食品微生物安全检测目的。利用定量细菌生长过程中释放的热量变化，以对微生物定量和定性的技术称为微热量技术。此外，随着代谢组学研究技术的发展和微生物挥发性代谢产物数据库的建立，食源性致病菌挥发性代谢产物分析已被建议作为临床和食品中致病菌鉴别的替代方法[4]。

4 生物传感器法

生物传感是指对生物活性物的理化性质变化产生感应，它通过物理、化学换能器捕捉目标物与敏感元件之间的反应，然后将反应的程度用不连续或连续的数字电信号呈现出来，从而得出目标物质的浓度。生物传感器法主要有光学传感器、生物发光传感器和压电免疫传感器三种。光学传感器适用于检测能产生荧光素的细菌，但灵敏度不高。生物发光传感法特异性好，可区分活菌体和死菌体，但检测耗时较长。压电免疫传感器有利于进行生命体活动的研究，因此成为生物传感器的研究热点之一。

5 免疫学技术法

利用抗原与抗体间的特异性结合反应，通过病原体的催化作用形成免疫球蛋白，可实现对食品微生物的免疫学检测。目前，免疫学技术广泛应用于检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌和弯曲杆菌等病原菌。免疫技术主要包括免疫层析技术、酶联免疫法和免疫磁珠。免疫层析是根据免疫抗体-抗原的相互吸附原理设计出的一种制备收集或检测分析技术。酶联免疫法是一种固相免疫测定技术，依据抗原抗体的特异性，并结合酶的作用，明确微生物的数量，具有灵敏度高、特异性强、方便快捷等特点，广泛应用于多细菌检测。免疫磁珠捕获法是通过免疫磁珠对目标微生物进行针对性的富集，提高传统方法的敏感性。《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》(GB 4789.1—2016)已将免疫磁珠捕获法作为检验大肠杆菌O157:H7的推荐方法。

6 分子生物学方法

随着分子生物学技术的快速发展和广泛应用，聚合酶链式反应(PCR)成为食品微生物检测常用的分子生物学技术之一。在食品微生物检测技术中，以具有高度保守的核酸序列为对象设计特异引物进行扩增，通常为16S rRNA基因的高变异片段，进行实时荧光定量或者凝胶电泳联合紫外核酸检测仪观察扩增结果，已到达最终检测食品中是否有某种致病菌的存在。在多种分子生物学手段中，依赖PCR的DNA指纹图谱技术、定量PCR技术、基因探针技术、多重PCR技术、基因芯片技术等均得以广泛应用。此外，还有基于等温扩增技术的环介导恒温扩增(LAMP)法、NASBA法等也被应用到食品微生物检测技术中。

6.1 DNA指纹图谱技术

DNA指纹图谱技术是基于改进的PCR技术，将目标微生物的核酸进行扩增，产生多条特异性与非特异性的DNA扩增片段，而后通过微生物的特有条带进行区别鉴定。DNA指纹图谱技术主要包括随机引物扩增DNA多态性(RAPD)技术和基因内重复性一致序列(ERIC)扩增技术。

6.2 多重PCR技术

多重PCR技术是在同一个反应体系中同时加入多对特异性引物，如样品中存在与各引物特异性互补的片段，即可同时扩增，实现一次扩增检测多种致病菌的目的。该方法适用于同时需要检测多个目标菌的样品，可大大提高检测效率。

6.3 定量PCR检测技术

定量PCR检测技术是在PCR反应体系中加入标记物，通过标记物的量变化或荧光强度变化，同时实现定性定量。应用较广泛的技术包括内标定量PCR和实时荧光定量PCR。在PCR反应管中加入内标物，可消除PCR扩增过程中不同反应体系间以及标本间存在的差异与干扰，因此，选择合适的标记物是内标定量PCR方法的关键点之一。实时荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累变化实时监测整个PCR进程的手段，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。RUDI等[5]采用实时定量PCR技术，快速检测出了食品样品中的单核增生李斯特氏菌。此外，其他研究者还利用PCR技术与免疫磁珠技术、酶联免疫法相结合，快速测定了食品中的大肠杆菌和沙门氏菌。

6.4 基因探针检测方法

每一种生物都有独特的核酸片段，病原微生物也有其特定DNA片段，通过分离和标记这些片段可制备出探针。基因探针技术已被广泛应用于食品安全微生物检测中，可灵敏、快速、直接的检测出样品中的特定目标微生物，而不受其他微生物类群存在的干扰。目前，市面上已有多种商品化的基因探针试剂盒出品，如美国Gene-Trak公司开发的利用特异的基因探针对单增李斯特氏菌、沙门氏菌、和大肠杆菌的16S rRNA进行检测的脱氧核糖核酸杂交筛选比色法试剂盒。

6.5 基因芯片技术

基因芯片技术是将大量已按检测要求制作好的探针固化，通过一次杂交同时检测多种靶基因的技术，是目前检测食品中有害微生物最有效最高效的手段之一。通过设计通用引物扩增细菌16S rRNA，然后将扩增产物与含有探针的芯片进行杂交，在短时间内即可鉴定出大肠杆菌(3～4 h)、沙门氏菌和葡萄球菌等致病性微生物。KIM等[6]采用比较基因组学技术，针对11种常见的食物源性致病微生物设计出了新型探针芯片，与全基因组芯片相比，可更加快速准确地检测出食品中的致病性微生物。

7 展望

随着微生物检测技术的不断发展，检测方法也越来越多样化。食品微生物检测技术将会向自动化、快速化、灵敏度高、特异性强、重复性好以及简易、经济的方向不断发展。每一种检测方法都有优点和缺点，为提高准确性，在食品检测时可根据实际情况选择合适的方法，也可以选择几种方法结合使用，不断提高检测的准确度，确保食品在制作、生产、包装和运输等每个环节中的质量安全。此外，检验人员在食品微生物检测中发挥着主导作用，要加强其对检测技术、流程和标准的掌握程度，将理论和实践紧密结合，从而获得精准的检测结果。

微生物污染存在于食品工业生产销售的整个过程，微生物种类繁多且容易变异，污染情况和分布规律复杂，检测技术相对落后和控制机理研究缺乏等诸多原因为食品微生物检测造成诸多困境。因此，不断加强我国食品微生物风险分析能力和微生物定量风险评估，以减少与发达国家的差距，切实保障粮食的质量安全，维护人们的根本利益，势在必行。建立食品微生物安全风险数据库是保障食品安全的基础手段之一，此数据库包括数据中心与资源共享平台、综合评价指标体系、综合评价指数模型和风险预警模型四大关键平台，其中综合评价指标体系由微生物菌种资源库、微生物检测项目库、微生物检测方法库、危害物质信息库、微生物安全国际标准指标库构成。通过数据库掌握了7大类食品的致病微生物污染率及污染水平，为微生物安全研究提供了基础数据和菌种资源，对我国建设高水平、高质量的食品安全保障体系具有重要意义。综上所述，食品安全关系国计民生，随着科学技术的不断发展，食品微生物检测方法和体系将不断完善，广大科研工作者需要共同努力，不断改进和丰富现有的检测技术，研发开创新的检测方法，为食品安全保驾护航。

参考文献

[1]吴清平,李玉冬,张菊梅.常见食源性致病菌代谢组学研究进展[J].微生物学通报,2016,43(3):609-618.

[2]李娜,王一村,高静静,等.快速检测技术在食品微生物检测中的应用研究[J].现代食品,2021,9(46):162-164.

[3]赵程.食品微生物检验和检测技术[J].现代食品,2020,15(35):120-122.

[4]吴清平.食品微生物安全风险数据库在包装饮用水行业的应用[J].饮料工业,2015,18(2):74-77.

[5]RUDI K,NATERSTAD K,DROMTORP S,et al.Detection of viable and dead on gouda-like cheeses by real-time PCR[J].Lett Appl Microbiol,2005,40(4):301-306.

[6]KIM H J,PARK S H,LEE T H,et al.Microarray detection of foodborne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics[J].Biosens Bioelectron,2008,24(2):238-246.