高效液相色谱法测定粮油食品中黄曲霉毒素含量

彭 立

(宜春市粮油质量监督检验站，江西宜春 336000)

摘 要：目的：选择高效液相色谱法对粮油制品中黄曲霉毒素B1展开快速测定。方法：提取、净化并浓缩样品中黄曲霉毒素B1后，确定流动相为乙酸铵溶液(5 mmol/L)、乙腈-甲醇溶液(50︰50)，以梯度洗脱程序为依据，采取液相色谱法展开测定，定量使用外标法。结果：在浓度范围为0.2～20 ng/mL时，黄曲霉毒素B1线性回归方程为=68 577.3-20 845，>0.998，线性关系良好;方法检出限为0.07 μg/kg、定量限为0.2 μg/kg;加标回收率超过85.0%，不超过5.5%。结论：本实验方法结果准确可靠、重复性好，可用于快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B1。

关键词：高效液相色谱法;粮油食品;黄曲霉毒素;含量测定

Determination of Aflatoxin in Cereals, Oils and Foods by HPLC

PENG Li

(Yichun Grain and Oil Quality Supervision and Inspection Station, Yichun 336000)

Abstract: objective: to develop an HPLC method for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products. Methods: after extraction, purification and concentration of aflatoxin B1 in the sample, the mobile phase was determined as ammonium acetate solution (5 mmol/L) and acetonitrile methanol solution (50:50). Based on the gradient elution procedure, the determination was carried out by liquid chromatography, and the external standard method was used quantitatively. Results: In the concentration range of 0.2～20 ng/mL, the linear regression equation of aflatoxin B1 was, and the linear relationship was good; The detection limit was 0.07 μg/kg,limit of quantitation 0.2 μg/kg;The recovery rate of standard addition is more than 85.0%,and the is not more than 5.5%.Conclusion: the results of this method are accurate, reliable and reproducible.It can be used for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products.

Keywords: high performance liquid chromatography; grain, oil and food; aflatoxin; content determination

黄曲霉与寄生曲霉等菌株在特定温湿度条件下会产生黄曲霉毒素，属于一类二级代谢产物，此类毒素对人体有强烈致癌危害。黄曲霉毒素包含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中毒性最强的为黄曲霉毒素B1。由于自然环境中存在的黄曲霉毒素相对较多，且对人类的危害性极高，因此有必要做好相关的控制工作。目前，在检测黄曲霉毒素时多选择液相色谱法、金标试纸法、酶联免疫法及液相色谱质谱联用法等。其中，高效液相色谱法具备极高的灵敏度和可观的准确性，能够精确定量黄曲霉毒素，因此被广泛应用于食品中黄曲霉毒素的检测。本文选择免疫亲和柱净化-高效液相色谱技术测定粮油食品中黄曲霉毒素B1。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈(色谱级);乙酸铵(分析纯);0.22 μm

微孔有机滤膜;黄曲霉毒素免疫亲和柱;黄曲霉毒素标准溶液(2 μg/mL)。实验用粮油样品获取自近期本地市场抽样。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪(Agilent 1260);电子天平(梅特勒ME204E型);涡旋混合器(vortex genie2);台式高速离心机(TG16)。

1.3 实验方法

1.3.1 配制标准储备液

精准量取黄曲霉毒素标准溶液，加入适量甲醇稀释为100 ng/mL浓度的标准储备液。

1.3.2 配制标准工作液

分别量取0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL标准储备液置于样品瓶内，加入初始比例流动相定容，完成浓度分别为0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL标准工作液的配制。

1.3.3 样品提取

精准称取5.00 g粮油样品置于离心管(50 mL)，加入甲醇-水溶液(70︰30)25.0 mL，涡旋混匀后转移至超声波仪内持续20 min提取后，再持续10 min离心(6 000 r/min)，收集上清液，待净化。

1.3.4 样品净化

精准量取上清液5.0 mL，加入含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液20 mL并混匀，待免疫亲和柱原有液体恢复至室温并流进后，用注射器装载上述样液，控制下滴流速为1.0 mL/min，全部下滴后用水淋洗免疫亲和柱(分2次，共计耗水20 mL)[1-2]。待滴完水后抽干免疫亲和柱，用甲醇洗脱免疫亲和柱(分2次，共计使用甲醇2 mL)，控制下滴流速为1.0 mL/min，用氮吹管装载收集的洗脱液，50 ℃下氮气吹干后，残渣用初始比例流动相(1 mL)溶解后，过0.22 μm微孔有机滤膜并转移至进样小瓶内，待测。

1.3.5 色谱条件

选择Shim-pack GIST C18色谱柱，100 mm×2.1 mm，2 μm;40 ℃柱温，0.3 mL/min柱流量，10 μL进样体积[3]。流动相A、B分别为乙酸铵溶液(5 mmol/L)、乙腈-甲醇溶液(50︰50).表1为梯度洗脱程序。

2 结果与分析

2.1 线性方程及相关性

根据1.3.1和1.3.2的步骤完成标准溶液的配制，检测不同浓度的标准溶液，参照对应化合物浓度(X)和目标化合物响应峰面积(Y)获取黄曲霉毒素B1线性回归方程为Y=68 577.3X-20 845，线性范围为0.2～20 ng/mL，R>0.998。

2.2 方法检出限

精准量取适量的标准工作溶液，移至空白样品溶液内，加入初始流动相逐级稀释，以检出限为信噪比S/N=3为根据，通过计算获取0.07 μg/kg的黄曲霉毒素B1检出限，以定量限为信噪比S/N=10为根据，通过计算获取0.2 μg/kg的黄曲霉毒素B1定量限。

2.3 加标回收率及重现性

分别精准称取空白粮油样品5.00 g，共计18份，围绕1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平对标准储备分别进行6次加标，通过处理检测后得到黄曲霉毒素B1加标回收率及相对标准偏差。加标回收率超过85.0%，处于2.8%～5.5%，见表2。

2.4 实际样品测定

为对该方法实用性与可靠性展开验证，参照上述实验方法对2种能力验证样品及3种市场粮油制品进行前处理后，获取黄曲霉毒素B1含量测定结果，见表3。根据两种能力验证样品中测定的黄曲霉毒素B1含量结果得知，比分数为-0.83，|Z|≤2，结果满意，证实了该方法的准确性。以《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中有关谷物及其制品、油脂及其制品中规定的黄曲霉毒素B1为5.0～20 μg/kg、10～20 μg/kg的安全限量为根据，市场粮油制品测定结果中的黄曲霉毒素B1含量与国家安全限量标准相符合。

2.5 实验验证

经提取、净化后的粮油制品，结合高效液相色谱法检测黄曲霉毒素B1，获取的结果与国家安全限量标准相符合，加标回收率超过85.0%，处于2.8%～5.5%。实际样品检测中，结果满意，证实了方法准确性。本实验方法结果准确可靠、重复性好，可用于快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B1。

3 讨论与结论

3.1 检测方法选择

目前，可用于检测黄曲霉毒素的方法有很多，如胶体金试纸条法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、薄层色谱法及免疫亲和柱-溴化荧光分光光度法等。其中，由于薄层色谱法会消耗大量溶剂，且重现性不太可观，因此在检测黄曲霉毒素中并不太适用[4]。胶体金试纸条法与酶联免疫吸附法一般在快速筛查黄曲霉毒素中应用，液相色谱质谱联用法能够同时检测多种真菌毒素，然而因本身需要使用过于昂贵的仪器，会产生较高的使用成本，故而也不太适用。免疫亲和柱无需消耗太多有机溶剂，且特异性强、机制干扰少、灵敏度高，在多种复杂基质样品中适用，在精确定量及确认黄曲霉毒素中十分适用[5]。因此，本试验在综合对比多种方法的优劣后，最终选择了免疫亲和柱净化-高效液相色谱技术对粮油食品中的黄曲霉毒素B1展开测定。

3.2 样品前处理优化

实验室检测样品中黄曲霉毒素时，在样品前处理方面多以手动净化的方式为主[6]。但是该净化方式涉及了过于烦琐的过程，且会消耗大量时间，每天能够完成的样本处理量较少，面对较大样品量时会暴露出人为因素影响大、时效性低等不足。而通过免疫亲和柱在线净化高效液相色谱法的应用，能将上述不足有效弥补，大幅提升检测时效性，且能为检测结果提供准确性保障。

3.3 流动相选择

以标准GB 5009.22—2016中洗脱程序为根据，以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸铵溶液为对象，对比流动相组合洗脱效果[7]。其中，甲醇-乙腈洗脱效率更显著，洗脱时间更短。通过乙酸铵溶液的添加，能获取对称性良好的峰型，出峰时间更稳定，单个样品测试时间更短。因此，在综合对比多种流动相的优劣后，本实验中确定流动相为甲醇-乙腈(50︰50)溶液和乙酸铵溶液(0.5 mmol/L)。

3.4 提取剂选择

本次实验前对提取剂选择甲醇-水溶液和乙腈-水溶液时的提取效果展开对比分析，分析得到两者之间不存在明显差异，确定提取剂为成本相对更低的甲醇-水[8]。

参考文献

[1]李丽,吴宇,王海波,等.全自动免疫亲和固相萃取超高效液相色谱法测定粮油中黄曲霉毒素[J].中国粮油学报,2020,35(7):165-172.

[2]李宗师.粮油食品中黄曲霉毒素检测技术研究[J].现代食品,2020(5):132-133.

[3]唐志峰,卢锦永.粮油食品中黄曲霉毒素的检测方法[J].现代食品,2017(1):80-81.

[4]甘仁榕,彭浏宇,肖靖松,等.超高效液相色谱法检测花生油中4种黄曲霉毒素的含量[J].中国卫生检验杂志,2016,26(8):1109-1111.

[5]任宏彬,贾晓婷,杨晓伟,等.高效液相色谱-串联质谱法快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B1的含量[J].食品安全质量检测学报,2019,10(19):6438-6442.

[6]田尔诺,杜馨,蔡俊.有机溶剂萃取-高效液相色谱法检测玉米浆中黄曲霉毒素B1[J].食品工业科技,2018,39(23):267-271.

[7]杨柳,王朝仁,杨黎耀,等.冷冻-离心净化-高效液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素B1[J].中国粮油学报,2020,35(1):169-175.

[8]林玉娜,罗晓燕,朱惠扬,等.广州市市售粮油食品中黄曲霉毒素B1的污染调查分析[J].医学动物防制,2019,35(7):86-88.