SPE-UPLC-MS/MS法测定方便面及其料包中5种罂粟壳生物碱

李坤全，王春雷

(聊城市检验检测中心，山东聊城 252000)

摘 要：选取方便面及其料包为研究对象，建立了固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用法(SPE-UPLC-MS/MS)测定方便面及其料包中5种罂粟壳生物碱的检测方法，样品经MCX固相萃取柱净化，C18柱分离，甲醇和0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱，电喷雾电离正离子模式，多反应监测(MRM)进行定性定量分析，二级质谱进行确证，考察了不同提取液、净化方式和色谱柱对实验回收率的影响。结果表明：罂粟碱、那可丁和蒂巴因在0.01～10.0 μg/L，吗啡和可待因在 0.1 ～ 100.0 μg/L 范围内线性关系良好，线性系数（r2）＞ 0.999 8，检出限为 0.21 ～ 1.24 μg/kg，定量限为 0.66 ～ 4.65 μg/kg，回收率为 72.02% ～ 110.09%，相对标准偏差为（RSD）为 1.05% ～ 4.25%。该方法净化效果好，检出限低，回收率高，精密度好，可应用于方便面及其料包中 5 种罂粟壳生物碱的检测。

关键词：罂粟壳生物碱;固相萃取;超高效液相色谱-质谱联用;基质效应;方便面

Determination of Five Papaveric Alkaloids in Instant Noodles and its Ingredients Package by SPE-UPLC-MS/MS Method

LI Kunquan, WANG Chunlei

(Liaocheng Inspection and Examination Center, Liaocheng 252000, China)

Abstract: In this research, we selected instant noodles and its ingredients package as research object and established one determination method of five papaveric alkaloids of this object by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry coupled with solid-phase extraction (SPE-UPLC-MS/MS). The samples were cleaned up by MCX solid-phase extraction column and separated on C18 column using 0.1% formic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase with gradient elution, and the target compounds were analysed by electrospray ionization in positive mode with multiple reaction monitoring (MRM) for qualitative and quantitative analysis. The secondary mass spectrometry was used to confirming. This paper also investigated the effects of different extraction solutions, purification methods and chromatographic columns on the experimental recovery. The results suggest that papaverine, noscapine, and thebaine showed a good linearity in the range of 0.01～10.0 μg/L, morphine and codeine also showed a good linearity in the range of 0.1～100.0 μg/L, and the linear coefficient

(2) was >0.999 8. Limits of detections were in the range of 0.21～1.24 μg/kg and limits of quantitations were in the range of 0.66～4.65 μg/kg. The recoveries of alkaloids in instant noodles were from 72.02% to 110.09% with relative standard deviations of 1.05%～4.25%. The method has the advantages of good purification effect, low detection limit, low quantitative limit, high recovery rate and good precision, and can be applied to the determination of 5 kinds of papaverium alkaloids in instant noodles and their packages.

Keywords: papaveric alkaloids; solid-phase extraction; ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; matrix effects; instant noodles

罂粟壳系成熟罂粟去掉果实之后干燥的果壳，其含有吗啡(Morphine)、可待因(Codeine)、那可丁(Noscapine)、罂粟碱(Papaverine)和蒂巴因(Thebaine)等生物碱[1]，这些成分有敛肺止咳、镇静止痛、止泻等功效[2]，但也有一定的成瘾性，一些不良商家正是看到了这一点，才铤而走险，将罂粟壳加入火锅底料、烹调香料、羊肉汤、麻辣烫、酱卤肉和饮料等食品中，以此来吸引“回头客”。如果长期食用这些食品会使人出现虚汗、乏力、面黄肌瘦、精神萎靡等[3]。2009年监管部门规定罂粟壳禁止添加于火锅食品中，2011年又将禁用的产品类别范围扩大为“火锅底料及小吃类食品”，并列出主要成分为“罂粟碱、那可汀、可待因、吗啡”，从而有效保证人们饮食安全。

目前罂粟壳生物碱的主要检测方法有光谱法(如分光光度法)、色谱法(如薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法)、电泳法、免疫分析法、质谱法(如气相色谱质谱法、液相色谱质谱法)等方法。这其中分光光度法只能对吗啡定性和半定量测定;薄层色谱法易受干扰;电泳法重现性差，多作为辅助检测方法;免疫分析法抗体保存时间有限，容易产生交叉反应;气相色谱法和气相色谱质谱法不适于难挥发、强极性和易热解化合物的检测，而液质联用法灵敏度、准确度高，精密度好，可进行痕量分析，各组分无需基线分离。

现有文献报道中研究者已经对酱卤肉[4]、火锅底料[5]、羊肉汤及汤料[6]、烹调香料[7]、药酒[8]和植物油[9]中5种罂粟壳生物碱成分进行了检测，但是还有一种备受消费者喜爱且容易越吃越上瘾的食品——方便面至今没有检测报道，故本研究从方便面切入，以固相萃取为净化手段，结合UPLC-MS/MS建立了方便面及其料包中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因5种生物碱的检测方法，准确度高、检出限低，二级质谱可有效避免假阳性的出现。

1 材料与方法

1.1 材料

方便面：均来自于政府组织的农村地区流通环节食品安全专项抽检中的方便面样品，其中B品牌、J品牌和K品牌各抽出10个，共计30个待测样品，并按照GB/T 5009.1—2003的要求制备样品。

1.2 试剂

甲醇(CH3OH，HPLC级)和乙腈(ACN，HPLC级)均购买于OCEANPAK公司;盐酸(分析纯，AR)和氨水(AR)均购买于烟台远东精细化工有限公司;正己烷(农残级)：天津市光复精细化工研究所;甲酸(HPLC级)：天津市大茂化学试剂厂;乙酸(HPLC级)：西陇科学股份有限公司;盐酸罂粟碱(1 μg/mL)、盐酸那可丁(1 μg/mL)、蒂巴因(1 μg/mL)、吗啡(50 μg/mL)、可待因(50 μg/mL)、吗啡-D3(100 μg/mL)和可待因-D3均购买于MEDJEN LLC公司;MCX固相萃取柱(150 mg，6 mL)：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制备

混合标准工作液：分别精密移取1 μg/mL罂粟碱、那可丁和蒂巴因溶液和50 μg/mL吗啡和可待因溶液各1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得含罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为100 µg/L和吗啡、可待因浓度为5 mg/L的混合标准品溶液。

混合内标工作液：分别精密移取吗啡-D3和可待因-D3内标物质(100 μg/mL)各1.00 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到吗啡-D3、可待因-D3的浓度均为1.0 μg/mL的混合内标溶液。

1.3.2 质谱条件

多反应监测模式(MRM)，正离子电喷雾离子化(ESI+)，离子化电压为5 500 V，离子源温度为550 ℃，气帘气压力为35 psi，雾化气压力为50 psi，辅助加热气压力为50 psi，各化合物的检测离子对、碰撞能量(Collision Energy，CE)、去簇电压(Declustering Potential，DP)、射入电压(Entrance Potential，EP)和碰撞室射出电压(Collision Cell Exit Potential，CXP)等质谱参数见表1。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Luna® Omega C18(2.1 mm×100 mm，1.6 µm);流动相;含 0.1% 甲酸水溶液为 A 相，甲醇为 B 相;梯度洗脱程序：0 ～ 1.00 min，70%A;1.00 ～ 3 min，70%A → 10%A;3 ～ 5 min，10%A; 5 ～ 5.1 min，100%A → 70%A;5.1 ～ 6.5 min，70%A;流速：0.4mL/min;进样量：10 µL。

1.3.4 样品前处理

准确称取样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，依次加入40 μl内标工作液和20 mL ACN-0.1 mol/L HCl(1∶4，V/V)溶液，涡旋混匀5 min，超声10 min，低温(4 ℃)8 000 r/min离心5 min，上清液转移至50 mL离心管中，加入20 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋振荡2 min，低温10 000 r/min离心3 min，下层液体待净化。取MCX固相萃取柱，使用前一次用6 mL水、6 mL ACN活化，准确移取5 mL下清液上柱，保持流速每滴1～2 s，然后依次用6 mL水、6 mL ACN淋洗去除杂质，用6 mL 5%(/)氨水乙腈洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，40 ℃氮吹至干，加入1.00 mL CH3OH-0.1%甲酸水(3∶7，V/V)定容，过0.22 μm滤膜后上机测试。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

5种生物碱均为碱性化合物，酸性环境中易溶于水，因此可用酸性溶液进行提取，提取液用有机溶剂萃取去除脂溶性杂质，再用固相萃取柱进行深度净化，最后洗脱液旋干复溶过膜上机测定。本实验分别用 0.1 mol/L HCl 溶液、1% 醋酸溶液、ACN-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 1，V/V)溶 液、ACN-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)溶液、CH3OH-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 1， V/V)溶 液 和 CH3OH-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)溶液进行加标回收，结果表明(图 1)，使用 0.1mol/L HCl 溶液和 1% 醋酸溶液进行提取时 5 种化合物的回收率基本上低于 50%，回收效果较差，当使用 ACN-0.1mol/L HCl(1 ∶ 1，V/V)溶 液、CH3OH-0.1 mol/L HCl(1∶1，V/V)溶液和CH3OH-0.1 mol/L HCl(1∶4， V/V)溶液提取时吗啡的回收效果较差，回收率小于50%，这可能是由于在前处理过程中出现乳化现象，当使用 ACN-0.1 mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)溶液进行提取时回收率均大于 80%，虽有乳化现象的发生，但可以通过低温高速离心尽量降低损失，故本实验最终将 ACN-0.1mol/L HCl(1 ∶ 4，V/V)作为提取液。

前处理过程中还有一项任务就是尽可能地去除溶剂效应和基质效应，食品样品种类多，基质复杂，要建立一个适合所有样品的高效统一的净化方法实属不易，因此实验过程中提取液净化后氮吹去除乙腈，然后再用初始流动相复溶，以此来减小溶剂效应;同时为更好地降低基质效应，实验过程中不同品牌的方便面使用不同的基质标准曲线。此外对于净化方式而言，DB 31/2010—2012[10]和BJS 201802[11]中加无水醋酸钠、无水硫酸镁的主要作用是除水和促进生物碱从水相转移到有机相，提取净化效率有待研究[12-13];还有学者[14]采用QuEChERS法净化，此法的确简便快捷，但是PSA能强力吸附吗啡，C18可吸附罂粟碱、蒂巴因、吗啡、可待因导致回收率较低，提取后直接进样会使基质干扰物增多;固相萃取是较为常见的净化手段，文献报道[15]使用C18柱吗啡无保留，HLB柱吗啡和那可丁无保留，由于5种生物碱极性较大，故可使用MCX和PCX来净化，实验中对比二者的净化效果，MCX略优于PCX，故最终采用MCX来净化。

2.2 线性范围、检出限和定量限

实验中以基质匹配的方法绘制标准曲线，将空白样品提取液作为稀释液，精确配制0.01～10.0 μg/L的罂粟碱、那可丁和蒂巴因的混合标准工作液，0.1～100.0 μg/L的吗啡和可待因的混合标准工作液(其中含吗啡-D3和可待因-D3均为10.0 μg/L)，各取5 μL上机测试，以标准品浓度为横坐标，罂粟碱、那可丁和蒂巴因以峰面积为纵坐标，吗啡和可待因以峰面积和内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，得到的线性方程、线性系数和线性范围见表2，结果表明罂粟碱、那可丁和蒂巴因在 0.01 ～ 10.00 μg/L 范围内，吗啡和可待因在 0.1 ～ 100.0 μg/L 范围内线性关系良好，线性系数(r2)> 0.999 8，这表明该法适用于方便面中 5 种罂粟壳类生物碱的检测。一般以信噪比(S/N) 为 3 的含量定为方法的检出限(LOD)，以信噪比(S/N) 为 10 的含量定为方法的定量限(LOQ)，5 种生物碱的检出限和定量限见表2，检出限介于0.21～1.24 μg/kg，定量限介于 0.66 ～ 4.65 μg/kg。

2.3 回收率和精密度

取空白样品(检测结果为阴性的样品)，每份称取2.0 g样品，分别加入低、中、高3个水平(其中罂粟碱、那可丁和蒂巴因的添加浓度为0.10 μg/kg、0.20 μg/kg和0.40 μg/kg，吗啡和可待因的添加浓度为2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg)的标准溶液适量，每个浓度平行6份，按照1.3.4的方法进行前处理制得待测溶液，上机检测含量，计算回收率，结果显示(表3)，在3种不同品牌的方便面中5种生物碱的回收率为72.02%～110.09%，相对标准偏差为(RSD)为1.05%～4.25%，说明该方法能够满足不同方便面样品的分析要求。具体来看吗啡和可待因的回收率(85.19%～110.09%)要明显优于罂粟碱、那可丁和蒂巴因的回收率(72.02%～107.21%)，这可能是因为吗啡和可待因采用内标法定量，能够很好地减小基质效应，而其余罂粟碱、那可丁和蒂巴因虽然采用基质匹配标曲外标法定量，但还会或多或少的受到基质干扰，而这一点在3种化合物0.10 μg/kg下的加标回收时尤为明显，因此以后的实验中可以采取其他方式(如在线稀释、开发内标定量法等)近一步降低基质效应。

2.4 二级质谱及其谱库建立

在实际工作中，由于食品样品基质复杂，传统质谱分析的MRM工作模式很容易产生基质效应，导致保留时间和离子比率有偏差，或出现“假峰”，产生假阳性，干扰判断。为克服此弊端，实验利用SCIEX复合质谱QTRAP系统独有的复合扫描模式MRM-IDA-EPI，即三重四极杆和线性离子阱的预扫描方式(Survey Scan)相结合触发增强离子扫描(EPI)，可以在一针进样的同时获得MRM色谱峰和增强型二级碎片，其中MRM色谱峰用来定量，EPI不同能量符合二级谱图形成“指纹”图谱，实现搜库和确证，确保检测结果的准确性。实验过程中取5种生物碱和两种内标物溶液单标(浓度为5 μg/L)依次进样，MRM-IDA-EPI采集模式，将得到的标准谱图和化合物信息加入数据库中，建立谱库并逐一对假阳性样品进行比对确认。

2.5 实际样品测定

采用本研究构建方法对政府抽检的3个品牌的方便面30个样品进行5种罂粟壳生物碱的定性筛查和定量分析，结果显示有3个样品(K品牌2个、B品牌1个)在保留时间1.15 min时吗啡两离子对出峰，4个样品(K品牌2个、J品牌2个)那可丁有一个离子对(414.2/220.2)出峰，4个样品(J品牌3个、K品牌2个)可待因有一个离子对(300.2/165.2)出峰，考虑到保留时间和离子比率等因素，采集这11个样品的二级质谱图，并与标准谱图进行对比，结果显示11个样品3种成分的匹配度(Purity)均小于50%，为阴性样品。

3 结论

本研究通过使用MCX柱对方便面样品进行提纯净化，并结合UPLC-MS/MS的MRM和MRM-IDA-EPI采集模式建立了方便面中5种罂粟壳生物碱的分析方法，方法检出限低，灵敏度高，准确度高，精密度好。采用超高效液相色谱，可在6.5 min内完成一个样品的分析，大大提高了分析效率，同时建立了5种生物碱的二级质谱图库，能有效快速地对阳性样品进行筛查，确保结果的准确性。本研究不但为罂粟壳生物碱检测方法国标的制定提供了参考，而且为依法打击食品中非法添加罂粟壳行为提供有利依据，保障消费者的合法利益。

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作者简介：李坤全(1978—)，男，山东聊城人，本科，工程师。研究方向：食品安全与质量。

王春雷(1988—)，男，山东聊城人，硕士，工程师。研究方向：食品安全与质量检测。