液相色谱串联质谱法测定豆芽中2种植物生长调节剂

崔　敏

(荣成市检验检测中心，山东荣成 264300)

摘　要：目的：建立了豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)和6-苄基腺嘌呤(6-BAP)的液相色谱-质谱联用仪的测定方法。方法：豆芽样品经酸化乙腈提取，LC-C18柱净化后，以甲醇和含5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸的流动相，经C18色谱柱分离，在UPLC-MS/MS的多反应监测模式下进行定性定量分析。结果：在10～200 ng/mL，2种植物生长调节剂有良好线性关系(2≥99.7%)，回收率为84.3%～94.6%，精密度为2.6%～10.3%，4-CPA的检出限和定量限分别为1.54 µg/kg和4.28 µg/kg，6-BAP的检出限和定量限分别为0.237 µg/kg和0.459 µg/kg。结论：该方法前处理简单快速、线性良好，回收率和精密度高，可以准确测定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量，满足国内外豆芽中对4-CPA和6-BAP限量的检测需求。

关键词：豆芽;液相色谱串联质谱法;植物生长调节剂;4-氯苯氧乙酸;6-苄基腺嘌呤

豆芽是餐桌上常见的美食，含有蛋白质、维生素和粗纤维等丰富的营养物质，具有补充人体所需氨基酸、降低胆固醇、促进肠胃蠕动和消肿利尿等作用，深受人们喜爱[1-3]。近年来，不法商贩为了缩短豆芽的生长周期和增加产量，在加工过程中使用了植物生长调节剂，促进植物细胞分裂、生长以及豆芽下胚轴增粗，抑制轴长和根部萌发，以达到加粗豆芽颈部生长的目的[4-6]。人们食用后，能引起恶心、呕吐等胃部不良反应，损害人体皮肤、食道、胃黏膜等，给人们的身体健康造成巨大危害[7-9]。市场监督管理局、农业部、国家卫生和计划生育委员会发布了《关于豆芽生产过程中禁止使用6-苄基腺嘌呤等物质的公告》(2015年第11号)，明确规定在豆芽生产过程中禁止使用4-氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤等物质[10]，并将其列为食品监管领域重点工作，在每年的国家食品安全监督抽检实施细则中均有体现。基于豆芽中植物生长调节剂的测定(BJS 201703)方法[11]，采用QuEChERS离心管净化样品时，会损失部分样品提取液，影响试验准确度，因此本研究建立了LC-C18固相萃取柱净化法，净化提取液时抽干萃取柱，损失极少，且操作简单快速，能够准确测定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量。

1　试验部分

1.1　试剂与药品

4-CPA和6-BAP为有证标准物质(北京坛墨质检科技股份有限公司);甲醇、乙腈(欧普森(Oceanpak)色谱纯);甲酸、乙酸铵、无水硫酸镁、无水乙酸钠(国药集团化学试剂北京有限公司);实验室用水符合GB/T 6682规定的一级水。

1.2　仪器与设备

三重四级杆液相色谱-串联质谱仪：TSQ Quantum Ultra EMR System，美国赛默飞世尔科技公司;电子分析天平：AR224CN，±0.000 1 g，上海天平仪器厂;高速冷冻离心机：CF16RXⅡ，日本日立;全自动均质器：AH-40，睿科;涡旋混合器：Vortex I，IKA;氮吹仪：MTN-5800，天津奥特赛恩斯仪器有限公司;超纯水系统：重庆摩尔水处理设备有限公司的MOL PW500EDI;C18色谱柱：thermo，hypersil gold(C18) 100 mm×2.1 mm，1.9 µm;LC-C18固相萃取柱：CNW，6 mL/500 mg。

1.3　试验方法

1.3.1　溶液的配制

(1)混合标准中间液的配制。4-CPA标准溶液和6-BAP标准溶液，含量均为100 µg/mL，准确吸取1 mL 2种标准溶液于10 mL容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成10 µg/mL的混合标准中间液;准确吸取10 µg/mL的混合标准中间液1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀释定容，将其变成质量浓度为1 µg/mL的混合标准中间液。

(2)含1%甲酸的乙腈溶液配制。量取10 mL甲酸，加入乙腈稀释至1 000 mL，混匀。

(3)含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液配制。称取0.385 4 g乙酸铵，用水溶解并稀释至1 000 mL，加入1 mL甲酸，混匀。

1.3.2　样品前处理

(1)提取。准确称取均质试样10.0 g(精确到0.1 g)置于50 mL的聚丙烯离心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速匀浆提取2 min，加入4 g无水硫酸镁和1 g无水硫酸钠，立即涡旋混合1 min，以10 000 r/min离心5 min使乙腈和水相分层。

(2)净化。LC-C18固相萃取柱，使用前用水和甲醇各6 mL活化，精确量取上层乙腈溶液4 mL于LC-C18固相萃取柱中，氮吹管接收净化液，并抽干萃取柱，于45 ℃氮气吹干，甲醇定容至1 mL，过0.22 µm有机滤膜上机测定。

1.3.3　标准曲线的绘制

准确称取空白试样10.0 g(准确到0.1 g)置于50 mL的聚丙烯离心管中，进行前处理，作为空白基质提取液。分别精确量取混合标准中间液(1 µg/mL)0 µL、10 µL、20 µL和40 µL，及标准混合中间液(10 µg/mL)10 µL、15 µL和20 µL，用空白基质提取液定容至1.0 mL，作为混合标准工作液，浓度依次为0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，临用时现配[11]。

1.3.4　仪器条件

色谱条件：C18色谱柱柱温：30 ℃，流动相：溶剂A(含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液)，溶剂B(甲醇);流速：0.25 mL/min;梯度洗脱条件：0～1 min 5%B，1～3 min 5%～95%B，3～7.1 min95%B，7.1～8 min 95%B，8～10 min 5%B。

质谱条件：ESI源，多反应监测(MRM)，氩气为碰撞气;毛细管温度(℃)：350，鞘气(Arb)：45，辅助气(Arb)：10，喷雾电压(V)：3 000，离子扫描模式：负离子扫描模式。

2　结果与讨论

2.1　质谱条件优化

取1 µg/mL的4-CPA和6-BAP混合标准中间液，在液相质谱联用仪ESI-模式下扫描，优化质谱条件，选择信号强度理想的母离子和子离子作为定性定量离子，筛选结果见表1。取100 ng/mL的4-CPA和6-BAP混合标准工作液，上机验证目标物出峰效果，4-CPA和6-BAP的总离子流图结果见图1，出峰时间分别为5.78 min和5.66 min，离子丰度比分别为34.1%和49.0%。

2.2　标准工作液曲线

4-CPA和6-BAP的系列混合标准工作液均为

0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，上机检测，外标法定量。结果数据分析，出现3个母离子，分别是质核比(m/z)为184.905的4-CPA、质核比(m/z)为187.000的4-CPA和质核比(/)为224.070的6-BAP，线性回归方程分别为：Y=729.645+769.358X、Y=3 779.49+2 249.89X和Y=1 991.1+5 621.12X，相关系数2为0.999 9、0.999 4和0.997 5，呈现线性良好，见图2。

2.3　回收率和精密度

豆芽样品中，加入4-CPA和6-BAP混合标准溶液，选择在10 µg/kg，20 µg/kg，100 µg/kg进行3水平回收试验，每个水平6个平行，回收率和精密度结果如表2所示，平均回收率为84.3%～94.6%，为2.6%～10.3%。

2.4　检出限和定量限

空白基质中加入4-CPA和6-BAP标准品进行前处理，上机测定，扣除基线后，以信噪比S/N=3时对应的含量为检出限，信噪比S/N=10时对应的含量为定量限，结果显示4-CPA的检出限和定量限分别为1.54 µg/kg和4.28 µg/kg，6-BAP的检出限和定量限分别为0.237 µg/kg和0.459 µg/kg。

3　结论

本文对豆芽中4-CPA和6-BAP的液相质谱联用检测法的前处理过程、液相色谱和质谱条件进行了优化，选择甲醇活化后的LC-C18固相萃取柱净化样品，操作简单、快速且准确度高。质谱条件优化后，筛选出了4-CPA和6-BAP响应强度较高的离子作为定量定性离子，其离子丰度比为分别为34.1%和49.0%，允许的相对偏差范围为±25%[12]，可以有效提高检测的准确性。结果显示该方法前处理简单快速、线性良好，回收率和精密度高，可以准确测定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量，满足国内外豆芽中对4-CPA和6-BAP限量的检测需求。

参考文献

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[10]佚名.国家食品药品监督管理总局 农业部 国家卫生和计划生育委员会关于豆芽生产过程中禁止使用6-苄基腺嘌呤等物质的公告[J].中国食品卫生杂志,2015,27(3):276.

[11]佚名.总局关于发布食品中西布曲明等化合物的测定等3项食品补充检验方法的公告[J].中国食品卫生杂志,2017,29(2):217.

[12]上海市食品药品检验所.BJS 201703 豆芽中植物生长调节剂的测定[EB/OL].(2017-07-07)[2021-10-09].https://www.doc88.com/p-3035672754514.html.