高效液相色谱柱后衍生法测定啤酒中甲醛含量

曾文祥1，李珍妮1，曾　川1，钟　敏2

(1.拱北海关技术中心，广东珠海 519000;2.广东药科大学，广东中山 528400)

摘　要：本文利用甲醛与乙酰丙酮及铵离子反应生产黄色产物原理，研究出高效液相色谱柱后衍生法测定啤酒中甲醛含量方法，考察了方法专属性、检出限、定量限、标准曲线线性范围、方法准确度、衍生温度及取样量因素，试验结果表明本方法检出限为0.2 mg/L，定量限为0.5 mg/L，甲醛上机浓度在0.01～5.0 mg/L范围线性良好，确定了衍生器反应温度为80 ℃，取样量为0.5 mL。本方法与GB/T 5009.49—2008相比，具有前处理简单，样品无需蒸馏，精密度准确度更高等优点。

关键词：啤酒;甲醛;高效液相色谱;柱后衍生

甲醛，化学式HCHO，又称蚁醛，是无色有刺激性气体，易溶于水和挥发于空气中，对人体眼鼻等有刺激性，长时间接触高浓度的甲醛容易致癌，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为一类致癌物[1]。近年来经常有报料食品中检出甲醛的新闻，食品中甲醛的来源广泛，主要有：①不良商家将甲醛添加至食品中用于保鲜;②甲醛是细胞生理代谢的正常产物，许多天然食品自身产生甲醛本底，如水产品及水发产品中的牛百叶、鱿鱼、银耳等[2];③食品生产过程中产生甲醛，如食品发酵。啤酒作为发酵食品，甲醛又是细胞代谢的正常产物，所以啤酒在生产过程中或有少量甲醛产生，《食品安全国家标准 发酵酒及其配制酒》(GB 2758—2012)规定啤酒中甲醛含量应≤2.0 mg/L[3]，故对啤酒进行甲醛检测，显得十分必要。目前啤酒中甲醛含量的检测方法主要为GB/T 5009.49—2008乙酰丙酮紫外分光光度法[4]，该方法需要对啤酒样品进行蒸馏除杂，蒸馏过程容易损失甲醛，导致结果偏低;同时甲醛与乙酰丙酮衍生产物不稳定，当样品数量比较多，或者实验员测定衍生产物吸光度速度不够快时，会导致前后样品从开始衍生到测定紫外吸光度时间差异较大，导致定量结果不准确。针对上述问题，参照《化妆品安全技术规范》(2015版)4.9节化妆品中游离甲醛的检测方法[5]，开发出高效液相色谱柱后衍生法测定啤酒中甲醛含量方法，相对于GB/T 5009.49—2008乙酰丙酮紫外分光光度法，本方法具有前处理时间更短、无需蒸馏、回收率更高、重现性更好、利用色谱柱分离，样品杂质干扰更少等优点。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

安捷伦1260高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器);Pickering柱后衍生仪;不同牌子啤酒市购;甲醛标准溶液：1 000 mg/L。试验所用试剂及配制：10%磷酸溶液，取1 mL磷酸溶液，用水定容至10mL;衍生化溶液，称取62.5 g乙酸铵，7.5 mL冰乙酸，5 mL乙酰丙酮，加水至1 000 mL。

1.2　色谱条件

色谱柱：Symmetry®C18(5 μm×250 mm×4.6 mm);流动相：0.2%磷酸溶液等度洗脱;流量：0.8 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：50 μL;检测波长：420 nm;柱后衍生仪衍生液流速：0.5 mL/min;柱后衍生反应器温度80 ℃。

1.3　实验方法

1.3.1　标准点溶液配制

取甲醛标准溶液，用水稀释成1 mg/L和10 mg/L，分别取稀释后的甲醛标准溶液适量于10 mL比色管中，加入0.2 mL 10%磷酸溶液，用水定容，配成浓度0 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和5.0 mg/L标准系列溶液，上机测定。

1.3.2　样品处理

准确移取0.5 mL样品于10 mL比色管中，加入0.2 mL 10%磷酸溶液，用水定容，过0.45 μm滤膜作为待测溶液，上机测定。

2　结果与分析

2.1　方法专属性

浓度为0 mg/L(试剂空白)的标准点色谱图目标峰(保留时间5.13 min)附近未出现干扰峰(图1)，方法专属性良好。

2.2　方法检出限与定量限

分别配制浓度为1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L和0 mg/L标准溶液系列，上机测定，用仪器软件计算信噪比(计算模式6SD，选取色谱5.5～7.5 min作为基线噪音)，信噪比结果见表1。

试验结果显示浓度为0 mg/L色谱图无目标峰，浓度0.01 mg/L的信噪比为6.3，浓度0.025 mg/L的信噪比为12.8，综合色谱图基线情况，分别拟取0.01 mg/L、0.025 mg/L作为本方法仪器检出限、定量限，对应方法的检测限和定量限分别为0.2 mg/L、0.5 mg/L。

移取0.5 mL样品，平行测定3次，实验结果显示空白样品甲醛含量低于检出限(0.076 5 mg/L);另移取0.5 mL样品，分别按照方法检出限0.2 mg/L和方法定量限浓度0.5 mg/L，加入甲醛标液，进行加标实验，平行测定6次，扣除样品空白后，计算回收率及变异系数，检出限加标平均回收率为105.9%，变异系数为7.80%(表2);定量限加标回收率为102.4%，变异系数为3.89%(表3)。样品空白及样品定量限浓度加标实验色谱图如图2、图3所示。

2.3　标准曲线

配制浓度0 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和5.0 mg/L标准系列溶液，上机测定，以甲醛浓度为横坐标，甲醛衍生物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。甲醛浓度在0.01～5 mg/L与之对应衍生物峰面积呈线性，线性方程为y=462.237 053x+1.683 071 8，相关系数为1.000。

2.4　方法准确度考察

取未检出甲醛(<0.2 mg/L)的空白样品0.5 mL，分别按照方法定量限、GB 2758—2012甲醛判定限量、10倍判定限量即0.5 mg/L、2.0 mg/L、20.0 mg/L浓度水平进行加标试验，平行试验6次，扣除样品空白，计算平均回收率和，试验结果显示(见表3)回收率在95.8%～102.4%，在0.70%～3.89%，本方法准确度良好。

2.5　柱后衍生反应器温度考察

配制浓度为1 mg/L的标准溶液，分别将柱后衍生仪反应器温度设为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃和120 ℃，每个设定温度下，重复进样3次，并计算平均峰面积。以温度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，绘制曲线图(图4);实验显示衍生物峰面积随衍生温度升高而变大，90 ℃衍生物峰面积达到最大，但与80 ℃差别不大，100～120 ℃衍生物峰面积有轻微变小，综合考虑衍生物峰面积和温度太高对仪器和衍生管路的影响，本方法以80 ℃作为柱后衍生仪反应器温度。

2.6　取样量对检测结果影响考察

取未检出甲醛(<0.2 mg/L)的空白样品适量于100 mL比色管中，加入0.2 mL浓度为1 000 mg/L的甲醛标液，用空白样品定容至刻度，制成浓度为2 mg/L加标样品。分别取加标样品0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL和8.0 mL于10 mL比色管中进行试验，按试验方法平行测定3次，计算3次平均回收率，以取样量为横坐标，平均回收率为纵坐标，绘制曲线图(图5)，试验显示当取样量为0.5 mL时，加标回收率最高96.7%，当增加取样量时，加标回收率降低，当取样量低于

0.5 mL时加标回收率稍微偏低，可能是取样量太少，上机浓度太低导致加标回收率偏低，故将0.5 mL确定为本方法取样量。

2.7　样品分析

按试验方法，对多种品牌啤酒进行空白样品检测，及判定限量2 mg/L浓度水平加标实验，实验结果显示各品牌的啤酒甲醛含量均为未检出(<0.2 mg/L)，甲醛含量均符合国家要求，2 mg/L水平加标回收率在92.3%～102.1%，说明本方法适用大多数品牌啤酒中甲醛含量测定，方法专属性强。

3　结论

本方法采用高效液相色谱分离出样液中的甲醛，再经过柱后衍生仪，在线与乙酰丙酮反应，在420 nm

波长下紫外检测器检测，经过试验验证，仪器最低响应浓度为0.01 mg/L，方法检出限和定量限分别为0.2 mg/L、0.5 mg/L，各浓度水平加标回收率及(n=6)均满足检测分析要求，确定了衍生器反应温度为80 ℃，最佳取样量为0.5 mL;本方法适用于市面上大多数品牌啤酒甲醛含量检测，各品牌啤酒2 mg/L浓度水平加标回收率在92.3%～102.1%。与GB/T 5009.49—2008方法相比，本方法只需取0.5 mL样品定容至10 mL和配制标准点溶液上机即可，样品前处理更加简便，无需蒸馏净化样品，同时确保了每个样品衍生化时间一致，检测结果精密度更高。

参考文献

[1]COLLINS J J.Formaldehyde exposure and leukaemia[J].OccupEnviron Med,2004,61(11):875-876.

[2]李娟,陈斌,游京晶,等.水产品及水发产品中甲醛含量本底值的调查研究[J].现代食品,2018(24):190-196.

[3]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准 发酵酒及其配制酒:GB 2758—2012[S].北京:中国标准出版社,2012.

[4]中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会.发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法:GB/T 5009.49—2008[S].北京:中国标准出版社,2008.

[5]国家食品药品监督管理总局组织完成.化妆品安全技术规范(2015年版)[Z].2016-12-01.