HPLC法测定陕北地区甜菊叶中甜菊糖苷含量

祁春雷，刘月霞，高　强，文　钰

(榆林合力生物科技有限公司，陕西榆林 719000)

摘　要：采用HPLC法测定陕北地区佳县、定边、米脂3个产地的甜菊叶样品中甜菊糖苷含量。通过超声提取得到甜菊叶中甜菊糖苷样品液，使用高效液相色谱仪检测甜菊糖苷样品液。采用C18反相色谱柱(250.0 mm×4.6 mm，5 m)，流动相为乙腈-磷酸钠缓冲液(30∶70，体积比)，梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温40 ℃，测定波长210 nm，进样量10 μL。结果表明，HPLC法操作简便、高效快速、稳定性好。

关键词：甜菊叶;甜菊糖苷;高效液相色谱法

甜菊叶属菊科，又名甜菊叶、甜草，是一种多年生草本植物，原产于南美洲巴拉圭巴西交界的阿曼山脉。甜菊糖是从甜菊叶中提取出的含甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B等9种甜味成分的四环二萜类化合物，其中，瑞鲍迪苷A甜菊苷含量最高，甜味品质最好，甜度是蔗糖甜度250～350倍，而热量仅为蔗糖的1/300。2008年末甜菊糖被美国食品药品管理局(FDA)批准使用，被誉为世界“第3类糖源”[1]。甜菊糖苷因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好，摄入人体后不被吸收，不产生热量等优点，被称为是天然、健康的新型无热量代糖产品，是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。可用于糖果、糕点、饮料、固体饮料、油炸小食品、调味料和蜜饯等食品加工领域。

目前关于甜菊叶中甜菊糖苷的测定方法有质量法、碱量法、分光光度法和薄层色谱法等。本试验拟采用高效液相色谱法对佳县、定边、米脂3个产地的甜菊叶样品进行甜菊糖苷检测，并分析甜菊叶里甜菊糖苷混合物中不同甜菊糖苷的含量，以期为甜菊叶质量评价提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

3份相同品种甜菊叶样品采于佳县、米脂、定边等地的农业企业或种植基地。乙腈、磷酸二氢钠、磷酸，均为色谱纯。磷酸钠缓冲液(pH2.6)：称取1.20 g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，溶于800 mL水中，用磷酸调节pH至2.6。流动相：乙腈-磷酸钠缓冲液(30∶70，体积比)。

甜菊苷标准品：甜菊苷含量(质量分数，以干基计)≥99.0%。瑞鲍迪苷A标准品：瑞鲍迪苷A含量(质量分数，以干基计)≥99.0%。其他7种糖苷标准品(质量分数，以干基计)≥99.0%：瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊双糖苷。

1.2　仪器与设备

高效液相色谱仪(日本岛津公司产品);紫外检测器;电子天平;超声波清洗仪(上海杰理科技有限公司产品)。

1.3　实验方法

1.3.1　色谱条件

C18反相色谱柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈：磷酸钠缓冲液=30∶70，梯度洗脱，流速1mL/min;柱温40 ℃;紫外检测器波长为210 nm，进样量10 μL。

1.3.2　标准品溶液制备

将甜菊糖苷标准品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，精密称取5 mg，溶液溶解并定容至10 mL，摇匀置于棕色瓶中。即配成浓度为0.5 mg/mL的标准品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。吸取10 μL标液进样，并记录。

1.3.3　供试样品溶液的制备

将3份甜菊叶样品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，粉碎后分别称取1 g放入烧杯中加入100 mL纯净水置于超声波清洗器中60 ℃超声提取1 h，高速离心20 min，收集过滤液并经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到备用样品。

2　结果与分析

2.1　精密度实验结果

取上述佳县供试样品溶液连续进样3次，进样量为10 μL，记录峰面积，计算甜菊苷(Stevioside，ST)、瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)、瑞鲍迪苷B(Rebaudioside B，RB)、瑞鲍迪苷C(Rebaudioside C，RC)、瑞鲍迪苷D(Rebaudioside D，RD)、瑞鲍迪苷F(Rebaudioside F，RF)、杜克苷A(DulcosideA，DA)、甜茶苷(Rubusoside，RUB)和甜菊双糖苷(Steviolbiosid，SB)的相对标准偏差(Relative Standard Deviation，)值分别为2.15%、2.23%、1.98%、2.13%、2.02%、1.89%、1.99%、2.10%和2.11%，表明HPLC法测定甜菊糖苷含量精密度良好[2]。

2.2　甜菊叶中甜菊糖苷含量

佳县、定边、米脂甜菊叶中甜菊糖苷的色谱图如图1～图3所示，具体含量见表1。甜菊叶中ST和RA含量占甜菊糖苷总量的比例是评价甜菊叶质量好坏的重要指标。表1结果显示，3个地区的总苷含量在15.20%～17.51%，其中米脂的总苷含量最高，定边的总苷含量最低[3]。不同地区各种成分含量差别比较大的是RA含量和RUB含量，其中，RA含量米脂最高、佳县次之、定边最低;RUB含量米脂最高、定边次之、佳县边最低，米脂的RUB含量是佳县的4倍[4]。

影响甜菊叶中甜菊糖苷含量的主要因素是温度、光照、生长周期[5]。定边甜菊叶种植在风力发电设备下，种植基地相对于佳县和米脂海拔高、温度低，导致甜菊叶的生长周期缩短，RA含量和总苷含量较低。而米脂种植基地在太阳能发电光板下，地势平坦、温度较其他两地高，但光照不足，影响了甜菊叶的质量。佳县是大面积、大规模平地种植，正常光照和温度，其RA占总苷含量最高。

3　结论

HPLC法测定甜叶菊中甜菊糖苷含量精密度良好，且能同时测定甜叶菊中甜菊糖苷总量及9种成分，包括甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊双糖苷的含量，为不同地区甜叶菊质量评价提供了一种操作简便、高效快速的检测方法。

参考文献

[1]罗庆云,印敏,陈玉江,等.酸性氧化铝前处理甜叶菊叶片甜菊糖苷分析样品的质谱验证[J].中国糖料,2019,41(4):24-29.

[2]安徽蚌埠惠农甜叶菊高科技发展有限公司.一种大量获得甜叶菊叶片产物甜菊糖苷RM的方法:201810683979.5[P].2018-11-30.

[3]洪维廉,陈睦传,李里焜,等.甜叶菊甙研究的进展[J].植物科学学报,1987,5(3):211-218.

[4]明光市大全甜叶菊专业合作社.一种提高甜叶菊中甜菊糖苷含量的方法:106631356A[P].2017-05-10.

[5]邓佐,夏延斌,王晓亮.简易HPLC法测定甜菊叶中甜菊糖苷[J].农产品加工·学刊(下),2013(10):14-15.