检验检测

乳及乳制品中β-内酰胺酶常用检测方法

2022-01-27 15:03:55 来源: 食品安全导刊

陈少华,肖幸宇,刘凤银*

(广东第二师范学院生物与食品工程学院,广东广州 510303)

摘 要:β-内酰胺酶是一类可以催化水解β-内酰胺类抗生素的水解酶,基于该原理,不法商贩为了躲避β-内酰胺类抗生素的检查,人为向乳及乳制品中加入β-内酰胺酶,营造“无抗奶”的假象,增加了乳品行业的安全风险。本文从乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性、残留危害、残留现状和检测方法进行阐述,通过分析当前常用的检测方法的优劣势,包括微生物分析法、仪器检测方法、快速检测方法,旨在为乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法提供参考。

关键词:乳及乳制品;β-内酰胺酶;检测方法;残留

β-内酰胺酶是一类水解酶,可以催化水解β-内酰胺类抗生素,导致抗生素失去抑菌活性。鉴于此,一些不法商贩为了追求经济利益,没有严格遵守休药期的规定进行采奶,导致牛奶中抗生素的残留,为了躲避检查,人为添加β-内酰胺酶,营造“无抗奶”的假象。β-内酰胺酶缺少安全性评价,其加入增加了乳品行业安全风险,因此针对乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测非常重要。目前尚未制定国家检测标准,仅在《生乳中β-内酰胺酶的测定》

(NY/T 3313—2018)中规定了生乳中β-内酰胺酶的测定方法——杯碟法[1]。本文主要从乳及乳制品中

β-内酰胺酶的稳定性、残留危害、残留现状和检测方法进行阐述,分析常用检测方法的优势与劣势,旨在为选择乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法提供参考依据。

1 乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性、残留危害和残留现状

1.1 乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性

β-内酰胺酶具有较强的耐热性和酸碱耐受性,市售牛奶大多采用巴氏灭菌或超高温瞬时灭菌,贮存于低温或常温条件下,在该加工工艺和贮存条件下并不能使牛奶中β-内酰胺酶完全失活,仍会有β-内酰胺酶残留。

范美婧等[2]探究了牛奶中β-内酰胺酶的稳定性,采用青霉素酶活性检测试剂盒,从牛奶的保存时间、灭菌方法和酸碱处理3个方面对β-内酰胺酶活性的影响进行研究。实验结果表明,低温条件对酶活性影响不大,≤4 ℃贮存一周仍能检出各个浓度的β-内酰胺酶;常温条件下,牛奶放置时间越长,酶活性越小,且减少程度与贮存温度呈正相关关系,25 ℃和37 ℃条件下牛奶样品贮存一周,酶活性降低;长时间高温加热会掩盖低浓度β-内酰胺酶的检出,巴氏灭菌和超高瞬时灭菌等常规灭菌方法并不能使β-内酰胺酸碱完全失活;市售酸奶pH为4~5,酸碱处理均会抑制低浓度β-内酰胺酶的活性,但未完全失活,当β-内酰胺酶浓度>3 U/mL时仍能检出,pH为6和7时最为稳定。

1.2 乳及乳制品中β-内酰胺酶的残留危害

①乳及乳制品中β-内酰胺酶添加来源不明确,缺乏安全评价数据,这对我国乳及乳制品的质量管理埋下了安全隐患;②β-内酰胺酶水解抗生素生成的青霉噻唑酸分解产物具有细胞毒性,抑制细胞繁殖能力,残留产物会在肝脏蓄积,成为潜在的健康风险;③非法加入β-内酰胺酶掩盖抗生素超标的现实,不仅极易造成奶制品市场抗生素使用泛滥,而且增加了耐药基因的水平和纵向传播风险,使人们抵抗传染病能力下降、肠道菌群紊乱,从而对人体健康造成危害。

1.3 乳制品中β-内酰胺酶的残留现状

2008年卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用性物质名单》中将β-内酰胺酶列为重点监控指标。各个地区的乳及乳制品检测中均有不同程度的β-内酰胺酶残留,部分地区β-内酰胺酶的检出率较高,因此加强乳及乳制品中残留的β-内酰胺酶监管力度,定期执行检测任务至关重要。

齐欣等[3](2021)采用杯碟法对辽宁省原料乳进行检测,结果186批次样品中β-内酰胺酶的检出率为12.4%;邱正勇(2019)等[4]采用胶体金检测法对河南省郑州市每月采集的60份生乳进行检测,结果β-内酰胺酶检出率波动较大,部分高达73.3%;秦婧[5](2016)对陕西省149份生鲜乳进行检测,其阳性检出率为11.4%;候海燕(2015)[6]对江苏省淮安市149份牛奶样品进行检测,其阳性率为16.8%。

2 乳及制品中β-内酰胺酶常用检测方法

2.1 微生物分析法

杯碟法检测牛奶中β-内酰胺酶的方法已经较为成熟,该法采用对青霉素敏感的藤黄微球菌,利用舒巴坦能够特异性抑制β-内酰胺酶的活性的性质,以青霉素作为对照,通过比较加入舒巴坦和未加入舒巴坦产生的抑菌圈大小,从而间接测定牛奶中是否含有β-内酰胺酶。

《生乳中β-内酰胺酶的测定》(NY/T 3313—2018)农业行业标准规定了生乳中β-内酰胺酶测定方法杯碟法[1],其检出限为生牛乳4 U/mL、生羊乳3 U/mL;刘旸等[7]研究两种添加藤黄微球菌的方法对牛奶中β-内酰胺酶检出限的影响,方法1制备成15 cm厚的单层培养基,方法2制备成双层培养基。实验发现方法2其抑菌圈边缘更加清晰,便于观察和测量,该方法灵敏度更高,其检出限在0.000 05~0.00 01 U/mL。

杯碟法是我国乳品行业认可的常用微生物检测方法,成本低,适用大批量检测,检测结果相对准确,但实验过程烦琐,周期长,容易出现假阳性现象,不能进行定量实验,对环境要求较高,不适用现场检测,具有一定的局限性。

2.2 仪器检测方法

2.2.1 高效液相色谱法

β-内酰胺酶能酶解青霉素,且青霉素浓度的减少量与酶活性呈线性关系,因此可以通过测定青霉素浓度减少量来间接检测β-内酰胺酶的含量。基于此原理,李雪芳等[8-9]通过离心除脂、无水乙醇除蛋白,采用高效液相色谱法测定了奶粉中β-内酰胺酶的含量,当β-内酰胺酶浓度在0.2~1.4 mg/L,与青霉素钾的减少量呈现较好的线性关系,回收率89.0%~95.0%,相对标准偏差3.0%~3.5%。

高效液相色谱法因其高灵敏度和高回收率得到广泛应用,但样品前处理较为烦琐,检测成本高,常用于实验室检测,不适合现场高通量检测。

2.2.2 分光光度法

利用β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗生素,其主要产物青霉噻唑酸具有还原性的性质,李滨等[10]建立检测牛奶中β-内酰胺酶的硫酸铜-紫外分光光度法,按照1∶1的比例加入三氯乙酸,辅以冷冻离心沉淀蛋白后,其最低检出限为5 U/mL;戴兴德等[11]基于青霉素分子的硫原子具有还原性,能将Fe3+还原成Fe2+,与[Fe(CN)6]3-生成可溶性普鲁士蓝,而酶水解产物和碱水解产物青霉素噻唑酸均不能与Fe3+反应,具有选择性。利用该原理,建立检测牛奶中β-内酰胺酶含量的普鲁士蓝显色光度法,该方法耗时短,仅35 min,β-内酰胺酶在4~24 U/mL与吸光值呈线性关系,检出限为0.32 U/mL,加标回收率为98.8%~101.2%。

分光光度法具有设备简单、维修方便、操作简单、实用性广、准确度和精密度好等优点,但提高其方法的选择性和降低检出限,一直是遏待解决的问题。

2.3 快速测定方法

β-内酰胺酶能水解青霉素,通过间接竞争法快速测定与β-内酰胺酶反应后残留青霉素的含量,从而间接检测出β-内酰胺酶的含量。

利用青霉噻唑酸能还原Cu2+为Cu+,与2,2-联喹啉生成紫红色络合物的性质,施春煜[12]将醋酸纤维素膜浸泡于亚铜试剂溶液中,真空干燥制成显色层,将过滤层、显色层和吸收材料粘贴在基板上,制成检测牛奶中β-内酰胺酶半定量快速测试纸,再结合分光测定仪制作标准比色卡,该方法最低检出限为6 U/mL,相对误差范围为7.51%~15.38%;张威等[13]采用Charm Rosa β-内酰胺酶试剂盒对150批乳及乳制品进行批量筛查,其检出限为4 U/mL,假阳性率为2%,灵敏度100%,特异性97.8%,具有高灵敏度和特异性,符合试剂盒快速筛查检测要求。

快速测试法具有较高的灵敏度,操作简单,检测速度快,基本能满足大批量筛选的要求,但容易出现假阳性,需结合杯碟法进一步验证。

参考文献

[1]李欣南,韩镌竹,苏崴艺.生鲜乳中β-内酰胺酶微生物法检测[J].中国乳品工业,2015,43(3):57-59.

[2]范美婧,陈媛,蔡兴航,等.不同处理方式对乳中β-内酰胺酶稳定性的影响[J].中国乳品工业,2017,45(4):8-10.

[3]齐欣,曲世超,薛伟锋,等.辽宁省原料乳中β-内酰胺酶的检测及结果分析[J].中国奶牛,2021(3):49-52.

[4]邱正勇,吴玲玲,李艳芬,等.郑州市生乳中微生物污染状况和β-内酰胺酶基线数据调查[J].中国卫生检验杂志,2019,29(17):2166-2168.

[5]秦婧,张莉,舒静,等.陕西省生鲜乳中β-内酰胺酶的检测与结果分析[J].中国乳品工业,2016,44(9):61-64.

[6]侯海燕,刘靓,刘纯成,等.淮安市市售乳制品中β-内酰胺酶残留状况调查[J].江苏预防医学,2015,26(6):92-93.

[7]刘旸,张丽宏,房玉国,等.杯碟法中藤黄微球菌的添加方式对生鲜乳中β-内酰胺酶检出限的影响[J].中国乳品工业,2021,49(2):39-41.

[8]李雪芳,冯卫强,戴绚丽.高效液相色谱法检测乳粉中活性β-内酰胺酶含量[J].饮料工业,2015,18(3):10-12.

[9]郝苗苗.乳及乳制品中β-内酰胺酶检测方法研究[J].中国饲料,2020(7):95-98.

[10]李滨,张俊杰,徐洁,等.牛奶中β-内酰胺酶检测方法的研究[J].现代食品,2021,27(11):186-189.

[11]戴兴德,郑小芳,火文琴,等.普鲁士蓝显色光度法测定牛奶中β-内酰胺酶的含量[J].中国生物制品学杂志,2021,34(2):207-212.

[12]施春煜.牛奶中β-内酰胺酶半定量快速检测试纸的研究[J].农产品加工,2016(23):11-13.

[13]张威,姜连阁.乳及乳制品中β-内酰胺酶快速检测试剂盒的比较研究[J].现代食品,2018(5):113-116.

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