PCR技术及其在食品微生物检测中的运用研究

2020-03-04 22:54:57 来源: 食品安全导刊

PCR技术及其在食品微生物检测中的运用研究

　　
　　随着收入水平的提高，老百姓对食品的消费能力越来越强，为适应人们的消费需求，市场上的食品类型也日益多样化和个性化。在这一形势下，食品质量安全检测工作十分重要。近年来，食品安全检测技术手段不断涌现，给食品安全检测工作提供了更多选择。其中PCR技术因其准确性和高效性在众多技术手段中脱颖而出，成为越来越多食品检测机构和部门采用的一种技术方法。
　　
　　PCR技术及其在食品微生物检测中的作用
　　
　　PCR技术是一种基因技术全称是聚合酶链式反应技术，该技术通过体外模拟DNA的复制过程来获得目标DNA片段，从而对实验对象的基因特征进行分析和判定。在食品微生物检测工作中，利用PCR技术能够对食品检测样品中的微生物，哪怕是含量很少的微生物进行基因标记及基因复制，可以在很短的时间内检测较多的食品样品，而且检测自动化程度高，操作简便，因此该方法在食品微生物检测中的运用效率很高。
　　
　　PCR技术在食品微生物检测中的应用方法
　　
　　PCR技术在食品微生物检测中的应用十分广泛，比如对金黄色葡萄球菌的检测、对绿脓杆菌的检测、对大肠杆菌的检测、对沙门氏菌的检测等等，均表现出较好的检测效果。金黄色葡萄球菌容易在蔬菜、瓜果等食品中生存繁殖，代谢产物中存在SE类型的有害物质，这种物质对食用者极可能造成食物中毒，PCR技术可以对食品样品中的SE物质进行微量检测，可精确到1pg。绿脓杆菌代谢产物中含有毒素的特定基因可以被PCR技术中的特定蛋白有效标记，通过特定蛋白的检测间接获得绿脓杆菌的含量。采用同样的原理，PCR技术可以对食品中的大肠杆菌、沙门氏菌进行特定基因扩增、标记，准确高效地得到这些微生物在食品样品中的含量。
　　
　　在实际应用中，PCR技术又可以分为以下几种测定方法。
　　
　　常规PCR检测法：测定目标物质的DNA模板和与之相对应的引物进行混合，然后向混合物中加入一定量的聚合酶。在特定的温度和催化剂条件狭隘，聚合酶会促使目标物质的DNA模板序列扩增，经历DNA复制的多个周期后便得到DNA片段。这一DNA片段可以作为循环DNA模板继续进行复制扩增。在放大目标物质后，对待测目标物质特定DNA进行标记测定，间接得到待测物的微生物含量。
　　
　　多重PCR检测法：该方法的原理是在常规PCR技术的基础上采用多个DNA引物，比如在同一个PCR反应体系里引入两个或两个以上的反应引物，在聚合酶的作用下，这些引物同时发生复制扩增，继而得到多个DNA片段。与常规PCR检测法不同的是，多重PCR检测法可以微生物的多个致病因子进行检测，而常规PCR检测法用于微生物单一致病因子的测定。该方法除了具有常规PCR检测法的高效性和准确性以外，还具有良好的系统性，能够对成组的微生物病原体或致病基因进行检测，因此是一种经济高效的食品微生物检测方法。
　　
　　PR-PCR检测法：此种检测方法是PCR检测法的变形，其技术原理是将检测目标中的一条RNA先进行逆转录得到与之互补的DNA，然后以得到的DNA链为模板再通过常规PCA技术进行DNA的复制扩增。此种检测方法的技术关键在于RNA的逆转录环节，必须确保RNA模板为完整的而且不含有蛋白质、DNA等杂质的基因链。PR-PCR检测法可以作为微生物检测的定性分析，还可以用于微生物检测的定量分析，比如将荧光技术和数字技术与PCR技术相结合，可以对检测目标中的微生物进行定量，检测具有较好的灵敏性，检测结果更加精确。
　　

　　上图为常见的食品微生物PCR检测方法的病毒基因图。图中，M列代表1000 bp DNA Marker；1列代表鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌；2列代表鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7；3列代表鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞性李斯特菌；4列代表金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7；5列代表金黄色葡萄球菌、单核细胞性李斯特菌；6列代表大肠杆菌O157：H7、大肠杆菌O157：H7；8列代表鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞性李斯特菌；9列代表金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞性李斯特菌；10列代表鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞性李斯特菌；11列代表鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞性李斯特菌；12列代表ddH2O。
　　
　　PCR技术的发展方向
　　
　　PCR技术在食品微生物检测中的应用越来越普遍，并发挥出越来越不容忽视的作用。未来，PCR技术的发展重点集中在三个方面。一方面，DNA或RNA模板的纯度要求越来越高。PCR技术检测结果的准确性在很大程度上取决于DNA或RNA模板的纯度，因此未来的研究工作会集中在DNA或RNA的提取方法研究上，以获得更高的提取效率和提取纯度。另一方面，PCR检测实验中出现的假阳性问题将进一步攻克。由于食品中的微生物种类多而且具有不稳定性，因此在PCR检测过程中会因为PCR技术方法的高灵敏度而出现一定的假阳性现象，在如何识别假阳性，如何避免假阳性问题上，未来将会有更多的方法，进一步提高PCR技术监测的准确性。第三方面，随着数据时代的到来，数据技术与PCR技术的结合也将更加紧密，演变为数字PCR技术。近几年，国内的数字PCR开发商已经有十几家，数字PCR技术的关键越来越侧重于芯片设计和制作，通过内置芯片实现微滴式可智能识别的质量控制目标，将自动化和智能化以数据的形势表达和呈现。芯片式数字PCR技术可以将微滴液体随机排布与芯片的阵列结构中，对于改善传统PCR技术中的热扩散造成的检测结果偏差十分有效。数字PCR技术突破了传统技术中检测结果受到标准溶液及标准曲线的限制，而且在高背景下也可以获得精准的检测结果，使基因定量检测结果的灵敏性和特异性大大提高，未来，数字PCR技术在食品微生物检测中应用前景良好。
　　
　　食品的安全监管和食品质量问题是国家和社会民众十分关注的问题。近年来，食品市场中的质量问题事件仍有发生，不仅破坏了市场的健康有序发展，而且给消费者带来了更多的不确定和不信任因素，影响到社会稳定和谐。食品检验检测工作容不得丝毫懈怠。在食品微生物检测中，PCR技术凭借高灵敏度和高准确度从众多的检测技术中脱颖而出。未来，食品检测部门及从业人员应继续围绕实际，加大探索力度，推动该技术应用水平的不断提升，为食品安全监管工作提供强大的技术支持。
　　

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