基质固相分散-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留
宋 磊
(贵州医科大学,公共卫生学院,贵州贵阳 550025)
摘 要:目的:建立鸡蛋中氟虫腈及代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。方法:在QuEChERS方法基础上,对提取溶液、盐析剂和净化剂等参数进行了优化。最终,样品以乙腈水提取,C18净化,UPLC-MS/MS测定。结果:氟虫腈及其代谢物在10~100 ng/mL范围内线性关系较好,相关系数r≥0.995,以3倍和10倍信噪比计算氟虫腈及其代谢物的检出限和定量限分别为0.162~0.685 µg/kg和0.541~2.285 µg/kg。在鸡蛋空白样品添加浓度为0.02 mg/kg水平下,氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈硫醚回收率范围为78.0%~107.4%,相对标准偏差(RSD)为3.93%~5.66%。结论:本方法快速、简便、准确,可用于鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留的测定。
关键词:基质固相分散;超高效液相色谱-串联质谱;氟虫腈;鸡蛋
鸡蛋蛋黄中的卵磷脂、甘油三酯、胆固醇和卵黄素对神经系统和身体发育有益,还能改善记忆力,鸡蛋中的蛋白质能够修复肝脏组织损伤[1]。在养殖过程中,兽药能预防和治疗疾病,这些药物在使用过程中会直接或间接地进入鸡体内,对人体健康产生影响。氟虫腈主要用于防治多种害虫[2],但是氟虫腈会对生态环境和人体健康造成影响,所以我国规定2009年10月1日起禁用氟虫腈[3]。
QuEChERS法具有快速、简便、廉价、有效、耐用、安全,是近年来应用日趋广泛的萃取技术,已被逐步用于兽药残留检测领域[4-5]。氟虫腈类药物的测定方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法等。UPLC-MS/MS在兽药残留检测方面具有强的定性和定量分析能力,广泛应用于农药和兽药残留的检测[6-8]。本研究通过试验探究QuEChERS方法结合UPLC-MS/MS检测鸡蛋中氟虫腈类抗菌药物残留的试验条件,建立了一种快速、有效、简便的测定鸡蛋中氟虫腈类药物的方法。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
试剂:乙腈、甲酸、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);实验室用水为Milli-Q超纯水;无水硫酸镁、氯化钠(徐州淞誉化工科技有限公司);C18购买于美国Waters公司;氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈和氟虫腈硫醚标准品溶液(100 µg/mL)(北京坛墨质检科技有限公司)。
仪器:Waters TQ MS超高效液相串联质谱仪(美国Waters公司);HC-3515高速离心机(日本日立公司);Milli-Q超纯水净仪(美国密理博公司);KQ-500V数控超声波清洗器;数显涡旋振荡器(美国赛默飞公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制
(1)混合标准储备液。分别吸取标准品溶液氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈硫醚1 mL至10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配成浓度为10 µg/mL的标准储备液。
(2)混合标准中间液。准确吸取混合标准储备液,用甲醇定容配成浓度为1.0 µg/mL的混合标准中间液。
(3)溶剂和基质标准溶液的配制。准确吸取适量混合标准中间液,浓度为1.0 µg/mL,用流动相初始比例逐级稀释成质量浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的溶剂混合标准溶液,基质标准溶液按照相同系列浓度配制。
1.2.2 样品前处理
称取鸡蛋样品2.00 g置于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈/水(9∶1,V/V)(含0.5%甲酸)作为提取溶剂,旋涡振荡均匀,加入1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠,剧烈振荡3 min,超声提取10 min,4 ℃条件下,10 000 r/min离心
5 min,吸取上清液加入含有10 mg C18净化管中,手动剧烈振荡3 min,4 ℃条件下,10 000 r/min离心5 min,0.22 µm滤膜过滤后,UPLC-MS/MS检测。
1.2.3 仪器条件
(1)色谱条件。色谱柱:Waters ACQUITY UPLC CSH C18(1.7 µm,100 mm×2.1 mm);柱温:30 ℃;进样量:10 µL;流速:0.2 mL/min;流动相A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0~6 min,10%~30% A;6~
9 min,30%~50% A;9~9.5 min,50%~100% A;9.5~
12.5 min,100% A;12.5~15 min,100%~10% A。
(2)质谱条件。电离方式:电喷雾电离源,负离子模式扫描,多反应监测(MRM);用MassLynx 4.1软件进行数据分析,毛细管电压为3.0 kV,去溶剂温度和离子源温度分别为400 ℃和150 ℃,碰撞气体(氩气)和去溶剂气体(氮气)流量分别为0.14 L/min和800 L/h。质谱多反应监测(MRM)参数见表1。
2 结果与分析
2.1 色谱和质谱条件优化
本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液共4种流动相在相同梯度洗脱条件,对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的分离度、灵敏度和峰型的影响。结果表明,4种化合物在不同体系中相应值比较为:甲醇-水<甲醇-0.1%甲酸溶液<乙腈-水=乙腈-0.1%甲酸溶液,故选择含有乙腈体系的流动相;试验对4种化合物在不同体系中的峰形进行比较,发现含有甲酸组的对称性优于不含甲酸组的。因此,本研究选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。
用甲醇分别配制氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的浓度为200 ng/mL,通过质谱注射泵直接进入质谱进行MS扫描,优化毛细管电压和碰撞能量,选择响应丰度较高、干扰较少的作为定量离子对。质谱参数见表1;氟虫腈药物的MRM色谱图见图1。
图1 氟虫腈药物色谱图
2.2 提取溶剂的优化
选择鸡蛋为试验样品,考察了甲醇/水(9∶1)、乙腈/水(9∶1)、乙腈/水(9∶1)(含0.1%甲酸)、乙腈/水(9∶1)(含0.5%甲酸)和乙腈/水(9∶1)(含1%甲酸)5种提取溶剂对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的提取效果。结果表明,含有乙腈组分的提取剂对组织渗透力强,对目标物提取效果好,且沉淀蛋白质及脂肪能力强,因此本试验选取乙腈作为提取溶剂。随着甲酸含量的加入,有利于目标物提取,当加入量超过0.5%时,提取效率明显降低。因此,选择乙腈/水(9∶1)(含0.5%甲酸)为本试验的提取溶剂,提取回收率在78%~107.4%。
2.3 盐析剂的优化
加入无水MgSO4可促使蛋白质变性分散,防止样品形成块状影响提取回收,同时能吸取提取溶剂中的水分,促进目标化合物溶解在乙腈层;加入氯化钠有利于水相和有机相分离,降低目标物在水层中的溶解度,更加有利于药物的提取。本文考察了9组盐析剂无水硫酸镁和氯化钠的组合,分别为2 g和3 g、2 g和2 g、2 g和1 g、1 g和3 g、1 g和2 g、1 g和1 g、0.5 g和3 g、0.5 g和2 g及0.5 g和1 g。在鸡蛋空白样品浓度为0.02 mg/kg添加水平下,随着无水硫酸镁含量增加,氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜回收率逐渐变大,当无水硫酸镁含量为1.0 g时,4种目标物的回收率为78%~107.4%,再次增加无水硫酸镁质量时,4种目标物的回收率出现明显下降;而在试验中选取的氯化钠的添加质量在1 g时,4种目标化合物的回收率最高。可能由于无水硫酸镁和氯化钠含量增加,造成失水严重而目标物被包裹在盐析剂空隙中。因此,选择1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠为盐析剂。
2.4 净化剂含量的优化
C18作为净化剂,可以去除鸡蛋样品中脂肪、维生素和甾醇等非极性物质,降低杂质的影响,减小基质效应,保证试验结果的准确性。试验考察了加入量分别为5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的净化剂C18对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜的影响。研究证明C18为10 mg时,添加浓度为0.02 mg/kg,兽药的回收率范围在78%~107.4%。
2.5 基质效应、检出限和定量限
按如下公式计算评价基质对各化合物的基质效应:
ME(%)=(B-A)/A×100
式中:ME为基质效应;A为初始流动相溶液标准曲线的斜率;B为基质配制标准曲线的斜率。若20%>ME>-20%,则为基质效应可以接受,否则存在较强的基质抑制或增强效应[9]。根据表2可知,4种药物在鸡蛋中的基质效应均在可接受范围内(20%>ME>-20%),为了定量准确,选择基质加标标准曲线法定量。
由表2可知,氟虫腈及其代谢物在10~100 ng/mL范围内线性关系较好,相关系数r≥0.995。以S/N=3和S/N=10计算检出限(LOD)和定量限(LOQ),4种目标化合物的LOD和LOQ分别为0.162~0.685 µg/kg和0.541~
2.285 µg/kg,满足鸡蛋中多种兽药残留的测定需求。
2.6 准确度和精密度
在鸡蛋空白样品添加浓度为0.02 mg/kg水平下,进行8次平行试验。采用基质匹配标准曲线进行定量分析,由表3可知,4种化合物的平均加标回收率在78.0%~107.4%,相对标准偏差在3.93%~5.66%,方法具有较好的准确度和重现性。
2.7 实际样品测定
样品《
食品安全国家标准 鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》(GB 23200.115—2018)和本方法同时检测1个阴性样品和2个阳性样品,获得的结果是一致的,同时做加标质量控制样品,4种药物的回收率在75%~112%范围内。样品中检测出氟甲腈,其余药物均未检出。根据结果显示,两种方法检测的结果差异小。
3 结论与讨论
本文建立了基质固相分散-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留方法。本方法快速、简便、灵敏度高、准确,可用于检测鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留同时测定。与现行国家标准及农业部公告相比,该方法能实现不同性质的多类兽药残留同时检测,大大缩短了检测周期,节约了检测成本,为相关的检测机构提供了理论依据和技术支持。
参考文献
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[9]国家卫生健康委员会,农业农村部,国家市场监督管理总局.
食品安全国家标准-鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定-液相色谱-质谱联用法:GB 23200.115—2018[S].北京:中国标准出版社,2018.