一种基于ATP荧光反应的洁净度检测系统的开发与验证

□ 柳江山 陶文靖 曲连海 周琦 北京美正生物科技有限公司

□ 张细玲 陈琳 达利食品集团有限公司

摘　要：本文旨在建立一种基于ATP荧光反应的洁净度检测系统，并对该系统的主要性能指标进行验证，包括线性、重复性、检出限及衰减率等，并对检测结果进行分析。结果显示，本拭子对ATP标准溶液的检出限为1.77×10-15mol/L，线性良好;对菌液的检出结果为：大肠埃希氏菌检出限2000CFU、金黄色葡萄球菌检出限800CFU、酵母菌检出限10CFU，均线性良好。该系统重复性良好，在高浓度ATP下，相对标准偏差(RSD)为8%;在低浓度ATP下，相对标准偏差为13%，均小于15%;在6min内，荧光衰减率无明显变化。故得出结论，本拭子的灵敏度、线性、重复性和衰减率指标均较好。

关键词：三磷酸腺苷 ATP荧光 洁净度 验证

随着目前国内对于食品安全的重视程度越来越高，食品微生物检测技术也在不断革新。传统的食品微生物检测方法一般为平板计数法，但该方法步骤繁琐，包括培养基制备、灭菌、样品均质与稀释、制备平板、恒温培养等多项操作，耗时至少2天，费时费力，已无法满足食品企业对于生产环境监测和质量控制的需求。此时，ATP荧光技术作为一种新的检测技术提供了新的设计思路——通过对细胞中的ATP进行检测，能够在短时间内估算被测物体上残留的微生物大致数量，从而实现对食品企业生产环境的快速检测，且能快速报告结果，在大大缩短检测时间的同时节省了人力与物力。

ATP又称腺嘌呤核苷三磷酸(简称“三磷酸腺苷”)，是一种不稳定的高能化合物，由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基团组成。ATP是生物体内最直接的能量来源，其在细胞中能通过与ADP的相互转化实现贮能和放能，从而保证细胞各项生命活动的能量供应。ATP生物发光法是产生于20世纪70年代中期的一种ATP检测方法，其检测原理为在有氧条件下，荧光素酶催化荧光素和ATP之间发生氧化反应生成氧化荧光素并发出荧光。因此，荧光强度与ATP含量呈正比，即待测样品中微生物数量越多，ATP的含量越高，发出的荧光越强[1，2]。手持式ATP荧光检测仪就是基于ATP生物发光的原理，利用专门研制的荧光检测仪和ATP涂抹拭子来捕捉和检测发光值，以及测定样本表面微生物污染程度的快速检测设备，具有操作简单、快速、适用范围广、携带方便、功耗低、对操作人员的专业技术水平要求低等优点[3-5]。本研究对洁净度检测系统进行检测效果的验证，分别从检测灵敏度、线性、重复性和衰减率这4个方面进行。

1 材料

1.1 仪器与试剂

PureTrustTM智能荧光检测仪，北京美正生物科技有限公司;ATP表面涂抹拭子，北京美正生物科技有限公司;ATP标准品(相对分子质量为507.18)，SIGMA;无菌水，北京美正生物科技有限公司。

1.2 菌株

大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、酵母菌(ATCC 10231)。

1.3 标准溶液配制

ATP标准储备溶液配制：准确称取一定量ATP标准品于100mL容量瓶中，用无菌水溶解并定容，配制成浓度为1.77×10-8mol/L的腺苷-5'-三磷酸标准储备溶液。用移液枪移取0.1mL ATP标准储备溶液，加入0.9mL无菌超纯水，制成浓度为1.77×10-9mol/L的ATP标准溶液，然后逐级稀释成浓度为1.77×10-10、1.77×10-11、1.77×10-12mol/L……1.77×10-16mol/L的ATP标准工作溶液，置于-20℃冷冻，备用。

2 检测方法

为确保检测结果的准确性和可靠性，实验过程需注意以下几个方面。①实验过程中，检测人员必须佩带手套和口罩，以此避免检测人员自身携带的ATP对实验结果造成影响;②拭子需冷藏放置，在使用之前需恢复至室温;③取拭子时不能触碰拭子头或柄，以免造成污染;④振摇拭子时不能上下摇动;⑤在测量过程中要保持荧光仪垂直。ATP荧光检测仪以相对光单位(relative light units，RLU)数值显示结果，RLU值与检测样本中的ATP含量呈正比。

2.1 灵敏度及线性

2.1.1 ATP标准品检测灵敏度

取浓度为1.77×10-10~1.77×10-15mol/L梯度的ATP标准溶液，从ATP表面涂抹拭子中取出棉签，用移液枪准确移取20μL ATP标准工作溶液滴于棉签头上，然后将棉签插回拭子管内并按下使其与底液接触，将检测管左右摇晃5~10s，充分混匀后，插入ATP检测仪，等待30s后开始检测。

2.1.2 菌体检测灵敏度

在对菌体进行检测时，选取较为常见的革兰氏阳性细菌(大肠埃希氏菌)、革兰氏阴性细菌(金黄色葡萄球菌)和真菌(酵母菌)这3种，检测本产品对不同构造菌体的裂解及检测能力。

2.1.2.1 大肠埃希氏菌

取浓度为1×108CFU/mL ATCC 25922新鲜菌液，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，从检测管中取出棉签，用移液枪准确移取20μL菌液滴于棉签头上，等待30s，然后将棉签插回检测管内并按下使其与底液接触，将检测管左右摇晃5~10s，充分混匀后，插入ATP荧光检测仪，等待30s后开始检测。将得到的荧光值与ATP浓度和菌液浓度进行线性分析，根据R2判断其线性是否良好。

2.1.2.2 金黄色葡萄球菌

取浓度为4×108CFU/mL ATCC 6538新鲜菌液，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度。从检测管中取出棉签，用移液枪准确移取20μL菌液滴于棉签头上，等待30s，然后将棉签插回检测管内并按下使其与底液接触，将检测管左右摇晃5~10s，充分混匀后，插入ATP检测仪，等待30s后开始检测。将得到的荧光值与ATP浓度和菌液浓度进行线性分析，根据R2判断其线性是否良好。

2.1.2.3 酵母菌

取5×106CFU/mL ATCC 10231新鲜菌液，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度，从检测管中取出棉签，用移液枪准确移取20μL菌液滴于棉签头上，等待30s，然后将棉签插回检测管内并按下使其与底液接触，将检测管左右摇晃5~10s，充分混匀后，插入ATP检测仪，等待30s后开始检测。将得到的荧光值与ATP浓度和菌液浓度进行线性分析，根据R2判断其线性是否良好。

2.2 重复性

用移液枪准确移取20μL不同浓度的ATP标准品稀释液(1.77x10-6mol/L浓度梯度和1.77x10-8mol/L浓度梯度)滴于棉签头上，然后将棉签插回拭子管内并按下使其与底液接触，左右摇晃5~10s，充分混匀后，将拭子插入ATP检测仪，等待30s后开始检测。重复测试10次，计算10次结果的相对标准偏差(RSD)，相对标准偏差应小于15%。

2.3 衰减率

测定仪器在5min内的荧光值衰减率。选择一个较高浓度ATP溶液(1.77x10-13mol/L)和一个较低浓度ATP溶液(1.77x10-15mol/L)，各吸取20μL滴加至拭子棉签上，测定反应发生后5min内的荧光衰减率，每隔一分钟测定一次荧光值，衰减率应不超过25%。

3 结果与分析

3.1灵敏度

3.1.1 ATP标准品检测灵敏度

本试验选择1.77×10-10~1.77×10-16mol/L的ATP标准溶液进行梯度实验，测得的不同浓度ATP标准溶液检测值如表1。

由表1可以看出，在1.77×10-10~1.77×10-16mol/L浓度范围内，仪器测得的荧光值随ATP浓度变化呈现明显的梯度差异，检测值随ATP浓度降低而减小。由图1可知，在1.77×10-10~1.77×10-16mol/L浓度范围内，仪器所测得的荧光值不仅呈现出明显的梯度差异，而且有较好的线性关系，线性方程为y=0.9589x+18.442(R²=0.9961)。所以，本系统可准确检测浓度在1.77×10-10~1.77×10-16mol/L范围内的标准ATP样品，最低检测限为1.77×10-15mol/L。

3.1.2 菌体检测灵敏度及线性

3.1.2.1 大肠埃希氏菌

大肠埃希氏菌是革兰氏阴性菌，本系统对大肠埃希氏菌的检测结果如下：

由表2可以看出，在2×106至2000CFU范围内，仪器测得的荧光值随菌液量变化呈现明显的梯度差异，检测值随菌量降低而减小。图2表明，在一定范围内，仪器测得的荧光值不仅有明显的梯度差异，且有良好的线性关系，线性方程为y=1.0062x-0.9009(R²=0.9719)。所以，本拭子可以准确检测CFU在2×106至2000范围内的大肠杆菌，最低检测限为2000CFU。

3.1.2.2 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，本系统对金黄色葡萄球菌的检测结果如表3。

由表3可以看出，在8×106至800CFU范围内，仪器测得的荧光值随菌液量变化呈现明显的梯度差异，检测值随菌量降低而减小。图3表明，在一定范围内，本仪器测得的荧光值与菌液浓度的线性关系较好，线性方程为y=1.0735x-2.079(R²=0.9969)。所以，本拭子可以准确检测CFU在8×106至800范围内的金黄色葡萄球菌，最低检测限为800CFU。

3.1.2.3 酵母菌

酵母菌属于真菌的一种，本系统对酵母菌的检测结果如表4。

由表4可以看出，在105至10CFU范围内，本系统测得的荧光值随菌液量变化呈现明显的梯度差异，检测值随菌量降低而减小。图4表明，在一定范围内，本仪器测得的荧光值与酵母菌液浓度的线性关系较好，线性方程为y=0.9046x+1.8542(R²=0.9916)。所以，本拭子可以准确检测CFU在105至10CFU范围内的酵母菌，最低检测限为10CFU。

3.2 重复性验证结果

选取ATP 1.77×10-13mol/L梯度和ATP 1.77×10-15mol/L梯度的标准溶液，测试拭子重复性，检测结果如表5。

由表5可以看出，在较高浓度ATP(1.77×10-13mol/L)情况下，检测10次，相对标准偏差为8%;在较低浓度ATP(1.77×10-15mol/L)情况下，检测10次，相对标准偏差为13%，高浓度和低浓度ATP条件下的检测重复性均小于15%。所以，本系统具有良好的可重复性和稳定性。

3.3 衰减率

使用ATP荧光法检测洁净度时，衰减率是一个重要指标——在ATP荧光反应中所生成的荧光容易发生降解，导致检测的时效性和稳定性都受到较大影响。本研究对待测拭子进行了衰减率检测，结果详见表6。

由表6可知，浓度为1.77×10-13mol/L的ATP溶液在检测第6min时，荧光值相比较最高荧光值是92%;浓度为1.77×10-15mol/L的ATP溶液在检测第6min时，荧光值相比较最高荧光值是106%。两次试验的衰减率均远小于25%，说明本系统具有良好的抗衰减能力，满足ATP检测要求。

4 讨论

本研究对一种基于ATP荧光反应的洁净度检测系统的灵敏度、线性、重复性和衰减率进行了验证，且验证结果良好;该系统对ATP标准溶液的检出限为1.77×10-15mol/L，线性良好。该系统对菌液的检出结果为：大肠埃希氏菌检出限2000CFU、金黄色葡萄球菌检出限800CFU、酵母菌检出限10CFU，均线性良好。同时，这一系统的重复性良好，在高浓度ATP下，重复检测10次，相对标准偏差(RSD)为8%;低浓度ATP下，重复检测10次，相对标准偏差为13%，均小于15%，满足要求。此外，在6min内，荧光衰减率没有明显变化。以上结果表明，该洁净度检测系统的基本性能可满足环境洁净度检测的要求。

参考文献：

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[2] 侯英，吴雪琼，王兴华.ATP生物发光原理及应用研究[J].中国医药导报，2010，(12):12-13.

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