乳及乳制品中卡那霉素残留快速检测产品应用

   
    1 卡那霉素的检测现状
    卡那霉素(Kanamycin)是一种氨基糖苷类抗生素，具有很强的抑菌作用，因价格低廉且抗菌性广，而作为兽药被广泛使用。然而，在动物实际养殖过程中，滥用卡那霉素的现象屡见不鲜，造成其在动物源性食品中存在残留，尤其是在乳品中的残留现象更为严重。过量的卡那霉素可给人体带来严重的副作用，主要包括肾毒性、造血系统毒性、过敏性等。另外，卡那霉素对婴幼儿有很强的耳毒性，会导致婴幼儿耳蜗细胞凋亡，严重者会造成听力丧失。因此，严格控制卡那霉素在乳品中的残留对保障乳品安全，维护消费者健康意义重大。
    由于我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部公告第235号）发布时间较早，所以公告中并未规定卡那霉素的限量要求。参照欧盟兽药残留限量标准，卡那霉素在乳品中的最高残留限量为150μg/kg，因此可预测我国的兽药残留限量标准修订会参考欧盟的限量标准对卡那霉素限量进行严格把控。目前，检测卡那霉素药物残留最普遍的方法为实验室检测方法，即仪器方法，如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱－质谱联用技术（LC-MS）等。虽然此类检测方法灵敏度高，但操作复杂，耗时较长，价格昂贵，因此也限制了其在现场实际的应用，故建立一种快速、灵敏、便捷的食品中卡那霉素的检测方法对于保障食品安全很有必要。
    北京维德维康生物技术有限公司（以下简称“维德维康”）基于前期深厚的研发基础，研制出一系列卡那霉素快速检测产品，包括卡那霉素酶联免疫试剂盒、卡那霉素胶体金快速检测试纸条等产品，可实现生鲜乳、原奶、奶粉、成品奶等多种质地乳品产品的快速定量、定性检测，覆盖乳品生产加工全产业链，可满足多层次用户的检测需求。其中胶体金快速检测试纸条操作简单、检测速度快，5min即可判读检测结果；酶联免疫试剂盒反应灵敏，检测限低至0.3μg/kg，达到行业领先技术水平。
    2 卡那霉素酶联免疫检测体系
    2.1 卡那霉素酶联免疫试剂盒检测原理
    酶联免疫吸附测定法是将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入底物显色，显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就可将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
    维德维康基于酶联免疫吸附测定法的原理，研制了卡那霉素酶联免疫试剂盒，用于快速检测乳品中卡那霉素药物残留。检测样品中的卡那霉素与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标记物，催化底物显色，根据显色的深浅来判断样品中卡那霉素的含量：显色深，含量少；显色浅，含量多。
    2.2 卡那霉素酶联免疫检测体系的组成
    卡那霉素酶联免疫检测体系由卡那霉素酶联免疫试剂盒和酶标仪两部分组成，酶联免疫试剂盒具有配套的96孔酶标板，板内包被维德维康自主研发的卡那霉素抗原物质，可与卡那霉素抗体特异性结合，敏感性强；试剂盒内配有酶标记物工作液，通过催化作用使底物显色，根据显色深浅可进行定量检测。酶标仪中内置标准曲线，可读取定量检测结果。
    2.3 卡那霉素酶联免疫检测体系的优点
    2.3.1 样本前处理简单快速：称取1g乳制品样本于离心管中；加入1mL 1%的三氯乙酸，震荡离心5min；取50μL中间层清液于2mL离心管中；加入950μL样品稀释液，充分混匀；待测。
    2.3.2 “一步法”检测步骤：将板条插入酶标板架上，依次加入50μL样品溶液、酶标记物工作液和抗体工作液；避光反应30min；充分洗涤，立即加入100μL底物溶液，避光反应15min；终止反应，用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值，即可得出定量检测结果。
    2.3.3 检测结果准确：随机选取3批卡那霉素酶联免疫试剂盒进行验证，结果证实，试剂盒在生鲜乳、原奶、奶粉、成品奶等多种类型样本中的检测限均可达到10μg/kg，添加回收率为70%~118%，批内批间变异系数均不超过10%。以《GB/T 22969-2008奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》中的液相色谱—串联质谱法的检测结果作为认定值，与卡那霉素酶联免疫试剂盒检测结果相比较，结果显示，两种方法的符合率达到99.5%以上，符合国家标准规定的检测范围。
    3 卡那霉素胶体金免疫层析
    快速检测体系
    3.1 卡那霉素胶体金免疫层析快速检测体系原理
    利用间接竞争原理，待测物和T线标记的抗原共同竞争金标抗体，根据胶体金试纸T线的显色情况，来定性判断待测样品中是否含有目标化合物。检测试纸条含有被事先固定于硝酸纤维素膜上的测试区（T）的抗原和控制区（C）的Ⅱ抗。微孔中的金标抗体经奶样溶解后，50℃孵育3min，将试纸条插入金标微孔中反应5min，根据T区、C区的颜色深浅对比判读结果。     3.2 卡那霉素胶体金免疫层析快速检测体系的组成
    卡那霉素胶体金免疫层析快速检测体系由卡那霉素试纸条、金标微孔和孵育器3部分组成，试纸条上具有检测线（T线）和质控线（C线），分别固定有抗原和Ⅱ抗，能够特异性结合金标抗体，灵敏度高；金标微孔内装有胶体金标记的抗体；孵育器为保温装置，可促进样本溶液流动并控制合适的反应温度。各部分组成如图1所示。
    3.3 卡那霉素胶体金免疫层析快速检测体系的优点
    3.3.1 前处理简单：胶体金免疫层析体系无需复杂的前处理，对于生鲜乳、原奶、成品奶等液态产品，只需充分摇匀即可检测；对于奶粉等样本，用去离子水溶解后也可直接检测。
    3.3.2 操作简单：检测时，吸取200μL奶样于金标微孔中，小心吹打至紫红色颗粒溶解，置于50℃孵育器内孵育3min，将试纸条插入金标微孔中，反应5min，取出试纸条即可判定检测结果。全程检测在10min内完成，反应时间快；无需额外有机化学试剂，绿色环保无污染；操作简单，无需专业培训，适合基层检测单位、质监部门现场快速监测及企业常规质检。
    3.3.3 判读精确：对于原奶和奶粉样本，卡那霉素快速检测试纸条检测限可达到3μg/kg，与目前欧盟兽药残留限量标准制定的限量值（150μg/kg）相比，灵敏度更高。同时，经大量实验验证，该产品的假阳性率可控制在3%以内，假阴性率低于1%；能够实现准确判读。
    3.3.4 包装小巧，便于携带：试纸条采用封闭包装，可有效避免环境中污染物质污染试纸条，影响检测结果。试纸条保存温度在20±5℃之间，即开即用，且有效期为12个月，适用于车间、市场、养殖场等多种检测环境，能够满足一线检测的需求。
    4 结论
    卡那霉素快速检测系统，包括卡那霉素酶联免疫试剂盒、卡那霉素胶体金快速检测试纸条等产品均具有检测准确度高、操作简单、便于携带的优势，能够实现生鲜乳、原奶、奶粉等多种乳及乳制品中卡那霉素残留的快速检测，填补了国内卡那霉素快速检测的空白，防止卡那霉素残留超标产品上市对消费者造成危害。同时，卡那霉素快速检测系统的使用和推广将有效提升各应用地区的乳品检测技术手水平，切实解决一线检测单位及生产企业经费不足、专业性差的问题，满足各级质检单位、乳品生产加工企业的检测需求，促进乳品产业链向着健康安全的方向发展。
    基金项目：石家庄市科学技术研究与发展计划（151490072A）支持。