HPLC法测定面包中 丙酸钙含量的不确定度评定

    测量不确定度是与测量结果相联系的参数，本文通过采用HPLC法测定了面包中丙酸钙的含量，并对其相对扩展不确定度进行了评定。
    丙酸钙作为防腐剂可以添加在焙烤类食品中，限量为2.5g/kg(以丙酸计)。高效液相色谱法(HPLC)是测定食品中丙酸钙的国家标准方法。测量不确定度是与测量结果相联系的参数，用于表征赋予被测量之值的分散性。当测量结果处于临界值时食品检验机构必须进行测量不确定度评定。本文对HPLC法测定面包中丙酸钙含量的不确定度因素进行了评定，计算出不确定度并报告了结果。
 
1 仪器、试剂、色谱分析条件
1.1 仪器
    高效液相色谱仪，岛津LC-20AT，附紫外检测器和自动进样器；高速冷冻离心机，北京雷勃尔LR10-2.4A；超声波清洗器，昆山市超声仪器KQ-100；高速组织捣碎机，上海精科DS-1；pH计,上海仪电科学PHS-3C；电子天平，上海上天FA2004；溶剂过滤器及0.45μm微孔滤膜。
 
1.2 试剂
    分析纯磷酸（H₃PO₄）、分析纯磷酸氢二铵[(NH₄)₂HPO₄]、实验室用超纯水、食品添加剂丙酸钙纯度标准物质(GBW(E)100078)。
 
1.3 色谱分析条件
    色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm,5μm,P.N.880975-914；流动相：1.5g/L；磷酸氢二铵溶液,用1mol/L磷酸溶液调pH为3.0(使用时配制)；经0.45μm微孔滤膜过滤；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；紫外检测器波长：214nm。
2 样品处理与标准溶液曲线的绘制
    依据国家标准GB 5009.120-2016进行试验。
 
2.1 样品制备
    将面包样品经组织捣碎机捣碎混匀，准确称取以上样品5g（精确至0.0001g）至100mL烧杯中，加水20mL，加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，混匀；经超声浸提10min后，用1mol/L磷酸溶液调pH为3左右，转移试样至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。将试样全部转移至50mL具塞塑料离心管中，以不低于4000r/min的速度离心10min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，待液相色谱测定。
 
2.2 标准曲线的绘制
    准确吸取5.0mL丙酸标准贮备液(10mg/mL)于50mL容量瓶中,用水稀释至刻度,配制成浓度为1.0mg/mL标准工作液。再准确吸取标准工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL至10mL容量瓶中，分别加入1mol/L磷酸0.2mL，用水定容至10mL，混匀。其丙酸标准溶液的最终浓度分别为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样分析，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
3 测量数学模型
样品中丙酸钙含量(以丙酸计),按式（1）计算:     式中:
    X为样品中丙酸钙的含量(以丙酸计),单位为克每千克(g/kg)；c是由标准曲线得出的样液中丙酸的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)；V是样液最后定容体积,单位为毫升(mL)；m为样品质量,单位为克(g)；f是稀释倍数。
    注：试样中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2569，即得丙酸钙含量。计算结果保留3位有效数字。
4 根据数学模型分析影响不确定度的因素
    不确定因素有以下几方面：①样品称量引起的不确定度；②样品平行测定引起的不确定度；③样品定容引入的不确定度；④标准系列溶液配置引起的不确定度；⑤标准曲线拟合引入的不确定度。
5 不确定度评定
5.1 样品称量引起的不确定度(B类不确定度)
    本试验所用电子天平为万分之一，最小分度值为0.1mg,由校正证书查得天平重复性标准差0.3mg，天平重复性标准差应计算为2次。则称样量为5.0026g，相对不确定度为：U_rel(m₁)=u(m₁)/m=0.00043/5.0026=8.6× 10^-5；
 
5.2 样品平行测定引起的不确定度（A类不确定度）
    试验中对同一样品丙酸钙的含量进行了3次平行测定其结果分别为：1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg，平均值 =1.08g/kg,标准偏差==0.0158g/kg,
    按均匀分布计算，其不确定度为U_A=0.0158/ =0.0091g/kg，则相对不确定度为U_rel(A)=UA/ =0.0091/1.08=8.4×10^-3；
 
5.3 样品定容体积引入的不确定度（B类不确定度）
    20℃时50mL A级容量瓶的允许误差为±0.05mL,按均匀分布计算，由此带来的不确定度为u=0.05/ =0.0289mL；50mL A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ,则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3 ×10^-2mL；试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1× 10^-4，温差变化引起体积的变化为：50 ×2 ×2.1× 10^-4=0.021mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：0.021/ =0.0121mL。
则样品定容引入的相对不确定度U_rel(v₁)= /50=6.8 ×10^-4。
 
5.4 标准系列溶液配制引入的不确定度(B类不确定度)
5.4.1 标准储备液引入的不确定度
    ①丙酸钙标准品的纯度，证书上给出的纯度99.7%，不确定度为0.6%，则标准物质引入的不确定度0.006/ =0.0035。
    ②本试验所用电子天平为万分之一，最小分度值为0.1mg,由校正证书查得天平重复性标准差0.3mg，天平重复性标准差应计算为2次。则u(m₂)==0.00043(g),称标准品为0.3146g，则由称量引入的相对不确定度为：0.00043/0.3146=0.0014。
    ③标准物质稀释引入的不确定度
    a.20℃时25mL A级容量瓶的允许误差为±0.03mL,按均匀分布计算，由此带来的不确定度为0.03/ =0.0173mL。
    b.25mL A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ,则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3 ×10^-2mL。
    试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1 ×10^-4，温差变化引起体积的变化为：25× 2 ×2.1× 10^-4=0.0105mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：0.0105/ =0.0061mL。则标准储备液由稀释引入的相对不确定度：U_rel(v₂)= /25=0.0009，由此，丙酸钙标准储备液引入的不确定度为：U_rel(标储)= =0.0039。
5.4.2 标准系列溶液由稀释引入的不确定度
    ①由5mL A级单标移液管引起的相对不确定度来自三个分量
    a.5mL A 级单标移液管引的容量误差查证书为±0.015mL，按均匀分布，不确定度为0.015/ =8.7× 10^-3(mL)。
    b.5mL A级单标移液管的充液重复性引起的不确定度，重复充液两次，用极差计算，其极差为R=0.015mL,由极差系数C及自由度υ，则由充液引入的不确定度为0.015/1.13=0.013(mL)。
    c.试验温度变化为±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4，按均匀分布，由温度变化引入的不确定度为2.1×10^-4×5× 2/=0.0012(mL)，则5mL A级单标移液管体积引入的不确定度为 =0.016(mL)，由此，5mL A级单标移液管体积引入的相对不确定度为0.016/5.00=0.0032。
    ②标液定容体积引入的不确定度
    a. 50mL A级容量瓶体积引入的相对不确定度。
    a₁.20℃时50mL A级容量瓶的允许误差为±0.05mL,按均匀分布计算，由此带来的不确定度为0.05/=0.0289mL。
    b₁.50mL A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3×10^-2mL。
    c₁.试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4，温差变化引起体积的变化为：50×2×2.1×10^-4=0.021mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：0.021/ =0.0121mL。
    由此，50mLA级容量瓶体积引入的相对不确定度为U_rel(v₂)= /50=6.8 ×10^-4
    b.10mL A级容量瓶体积引入的相对不确定度
    a₁.20℃时10mL A级容量瓶的允许误差为±0.02mL,按均匀分布计算，由此带来的不确定度为0.02/ =0.0115mL。
    b₁.10mL A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3×10^-2mL。
    c₁.试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1×10^-4，温差变化引起体积的变化为：10×2×2.1 ×10^-4=0.0042mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：0.0042/ =0.0024mL。
    由此，10mL A级容量瓶体积引入的相对不确定度为：U_rel(v₄)= /10=1.75×10^-2
    至此，标准系列溶液由稀释引入的不确定度：Urel(v₅)= =0.018
 
5.5 标准曲线拟合引起的不确定度
    采用7个浓度水平丙酸钙标准溶液，得出峰面积，用最小二乘法拟合，得到标准曲线
Y=175471x+2485.6，本试验对同一样品进行了3次测量，求得平均值 =1.08g/kg，因此由标准曲线拟合带来的标准不确定度为：
 
    式中：SR回归曲线的剩余标准差，b为斜率，p为待测样品的重复测定次数(p=3),n为回归曲线的点数n=7，c待测样品浓度的平均值，c₀为回归曲线各点浓度的平均值，c_0i为各标准溶液浓度值。
     


    由上述表中数据计算出SR回归曲线的剩余标准差，即：
 
 

    扩展不确定度：取p=95%，k_p=2，则U=u_c k=0.025×2=0.05g/kg
    报告结果：1.08±0.05g/kg(k=2)
    不确定度表达测量结果的分散程度，是一个定量的概念，可以用定量的数字描述。本文对HPLC法测定面包中丙酸钙含量的不确定度因素进行了评定，若检测结果处于标准限量的临界值或标准方法有要求时，必须结合不确定对检测结果进行评判。