应用拉曼光谱技术开展乳制品安全快检的探讨

陈　泳1，林子旭1，宋　欢2，花 锦2*

(1.漳州海关综合技术服务中心，福建漳州 363005;
2.太原海关技术中心，山西太原 030024)

摘 要：本文从产品真伪鉴别、药物残留、污染物、食品添加剂和非法添加物5个方面，全面概括、归纳、总结拉曼光谱技术在检测乳制品理化安全指标的研究进展，分析了拉曼光谱技术应用的优势和劣势，探讨了拉曼光谱技术的应用前景，为乳制品安全快检提供参考。

关键词：拉曼光谱;乳制品;安全快检

乳制品指的是使用牛乳或羊乳及其加工制品为主要原料，加入或不加入适量的维生素、矿物质和其他辅料，使用法律法规及标准规定所要求的条件，加工制作的产品[1-2]。乳制品的质量与安全是一个全球性的重要食品问题，许多国家纷纷采取立法、行政、司法以及检验监督等措施，保障乳制品的质量与安全[3]。就理化安全指标而言，乳制品长期面临着以下几方面风险的挑战。

①乳制品原料、半成品或成品的掺伪和假冒行为。如在高价值的羊乳粉中掺入价值较低的牛乳粉，在高端品牌乳粉中掺入廉价品牌的乳粉，冒充乳粉原产地造假等。②乳制品的药物残留问题。一方面，产乳牲畜在成长期、哺乳期食用了受到农药污染的牧草和饲料，另一方面，牧民为维持牲畜健康使用了杀虫剂和抗生素，这些农药和兽药的残留物或代谢产物可能会伴随生乳带入乳制品[4]。③乳制品的污染物问题。产乳牲畜在放牧和饮水过程中对环境污染物的摄食，加工设备在生产过程中使用的化学消毒试剂，以及加工环境都可能使乳制品带入或产生污染物，从而危害人体健康[5]。④食品添加剂的超限量使用。食品添加剂可以改善乳制品的色泽、风味、外观和口感，方便加工和储存，但超限量使用食品添加剂一定程度上会影响人体健康，因此，要按照国家标准的规定严格控制食品添加剂用量[6]。⑤非法添加物。最为典型的案例是2008年的毒奶粉事件。2008年，中国三鹿等公司销售含添加了三聚氰胺的牛乳和婴儿配方乳粉，导致肾结石和肾功能衰竭的患病人群近30万，其中6名婴儿死亡[7]。三聚氰胺并非食品添加剂，而是用来掩蔽乳制品中蛋白质含量不足的非法添加物，这些添加物因对人体的危害重大，严禁添加在食品中。

鉴于乳制品已成为大众化的重要食品，它的质量安全备受监管部门和消费者关注，乳制品安全指标的检测手段也日益丰富。2010年起至今，我国已先后颁布乳制品检测方法标准49项，其中理化检验方法39项，主要涉及污染物、农兽药残留、营养成分及一些禁止添加或限量添加的指标。我国已经基本建立起了较为完善的乳制品检测方法标准体系，然而，这些标准方法多为实验室方法，检测成本高、周期长，甚至有超出产品保质期的风险。对于进口乳制品而言，实验室检测周期长会严重影响通关速度，因此海关系统急需建立一套针对乳制品的安全指标快速检测技术(下文简称“快检”)[8]。快检是一种快速定性或定量的检测技术，该技术具有设备易于携带、耗时短、操作方便等优点，特别适用于一线现场监管。目前常用的快检技术主要有酶抑制法、化学比色法、生物芯片法、胶体金免疫层析法、拉曼光谱法、生物化学发光法和生物传感器法等[9]。近年来，拉曼光谱技术在食品检测的应用成为新热点，便携式拉曼光谱仪携带方便，操作简单，检测速度快，因此有很大的现场执法应用潜力。目前，关于拉曼技术在乳制品快检领域的应用研究较多，本文在参考国内外相关研究文献报道的基础上，结合海关总署科研项目“拉曼光谱技术在进口乳粉掺假快速鉴定中应用研究”(2019HK120)的研究结果，对拉曼快检技术在乳制品快检方面的应用前景做总结分析。

1 掺伪或冒牌产品的鉴别

在乳制品中，乳粉(包括婴幼儿配方乳粉)是货值最高的产品，也是最容易被仿冒的，对进口乳粉而言，最常见的是原产地造假[10-12]。有研究表明，相比国产品牌，消费者对欧盟品牌有最高的购买意愿，新西兰品牌次之，因此原产欧洲和新西兰的乳粉更可能被其他产地乳粉冒充[13]。针对乳粉的品牌冒充或掺伪现象，近年来已有应用SERS技术进行鉴别的研究。由于乳粉是一种成分相当复杂且非完全均匀的固体粉末，单纯分析各个品牌乳粉的拉曼光谱信号，会发现不同品牌乳粉的拉曼特征峰并无显著差异，只有局部或细微差异。这些差异源于蛋白质、脂肪和碳水化合物的含量差异，因为这种差异不够显著，需要借助化学计量学的方法对拉曼光谱信息进行处理分析，才能最终进行判别[14]。

张正勇等[15]将乳粉置于多孔芯片平台，用便携式拉曼光谱仪直接扫描样品采集信号，再对样品的光谱信号值进行相关系数计算，比较同一品牌乳粉内部以及5个品牌乳粉间的相似度差异，并构建质量波动控制图。结果显示同一品牌乳粉内部拉曼光谱信号相似度高(在0.999 2～0.999 7范围内波动)，而不同品牌乳粉间拉曼光谱信号相似度较低(在0.950～0.995范围内波动)，据此结合质量波动控制图，可初步实现不同品牌乳粉的鉴别。该研究的方法虽然简便快捷，但研究中用作比对的A品牌在做内部比较时并没有提及这些样品是否为同一罐、同一批次乳粉，或者是不同批次乳粉，因此不能排除不同生产日期、不同批次产品之间相似度大幅波动的可能。为进一步验证该方法的适用性，本研究采集了6种品牌的乳粉，每种品牌采集3个不同生产日期样本，同一品牌乳粉的生产日期间隔3个月，运用张正勇等的方法对6种品牌乳粉进行鉴别。

结果如表1所示，为避免争议，品牌以字母代替。①品牌内部考察。品牌B、C、E的相关系数值均在0.99以上，波动区间均在0.000 8以内;品牌A、D、F的相关系数值最低的甚至低于0.90，最高的也在0.99以下，波动区间分别为0.047 2、0.067 9和0.012 7。②品牌间考察。各品牌任选一个生产日期的批次与A品牌的信号均值进行相关系数计算，结果在0.929 8～0.974 6范围内波动，这与A品牌内部系数相比，并没有显著差异，甚至E品牌与A品牌的相关系数值超过了A品牌内部的所有相关系数值。这表明不同品牌乳粉的产品稳定性差异很大，有些品牌很稳定，有些品牌不同生产日期间差异较为显著，因此无法断定不同品牌间相关系数值的差异度究竟是来源于品牌间差异还是来源于品牌本身原料和生产过程的稳定性差异，运用全谱数据结合相关系数运算难以真正有效鉴别乳粉品牌。

王海燕等[14]将两种乳粉按不同比例混合成5种掺伪乳粉，提取掺伪乳粉中的脂肪，采集脂肪样本的拉曼光谱特征峰值，结合主成分分析(Kernel Principal Component Analysis，KPCA)运算和最近邻算法(Nearest Neighbor，NN)模型对5种脂肪样本进行识别，10次交叉验证下的平均识别率达到98.89%，平均运算时间只有0.104 s。该研究采用的样本数量充分，每个品牌乳粉采集了10个，生产日期区间为7个月，同时考虑到样品的均匀性对拉曼谱图重复性的影响，采用液液萃取法提取掺假乳粉中的脂肪作为掺假乳粉的供试品，并且运用了KPCA方法对采集的数据进行了可视化描述，运用NN模型开展交叉验证实验，论证充分，为乳粉的掺伪鉴别应用指明了前景。然而，该研究方法需要对样品的脂肪进行提取，提取过程需要在实验室条件下开展，全流程至少需要12 h，显然还不适用于现场监管的快检。

2 药物残留的检测

随着农药残留和兽药残留问题受到社会的普遍关注，拉曼技术在药物残留检测领域的应用研究也比较多，然而聚焦乳制品的研究并不多，主要的研究方向是牛乳中的兽药残留。有相关研究报道的兽药有氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素和磺胺吡啶[16-19]。此外，本文研究对牛乳中的恩诺沙星、达氟沙星以及庆大霉素的拉曼快检技术可行性进行了评估。表2根据方法的检测限以及《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》(GB 31650—2019)对现阶段文献及本文研究的兽药残留拉曼快检可行性做出了简单评估。从表2可知，目前利用拉曼快检技术检测牛乳能有效检出的兽药还非常有限，这可能是因为牛乳的基体比较复杂，兽药残留分子在牛乳基体中的拉曼信号普遍较低。要提高药物残留分子的拉曼信号必须采用表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy，下文简称“SERS”)技术，同时对金属纳米检测探针和SERS基底材料进行优化。SERS技术表现出很高的专属特异性，即需要针对不同类型的分子设计出不同的纳米探针和基底[20]，这和目前一些已经市场化的快检技术有所不同。目前市场流行的快检方法如酶抑制率法和胶体金法，可以很快地检出样品是否含某类药残，如四环素类和喹诺酮类等，但在检出具体项目上，如四环素和恩诺沙星，SERS技术因其专属特异性，具有更大优势。

3 污染物的检测

乳制品主要存在的污染物有汞、镉、砷、铅、铬等重金属离子以及亚硝酸盐、硝酸盐、苯并芘等。常规的SERS技术在重金属离子检测中存在选择性差、检出限高、检测范围窄的问题，以贵金属纳米粒子及粗糙表面组成的SERS活性基底的制备成为应用SERS技术高效检测重金属离子的关键[21]。据梁营芳等[22]总结主要的重金属离子几乎都找到了合适的专属SERS基底，应用该技术在水中的检测限最低达到1.7×10-10 mg/mL，最高1×10-4 mg/mL，远低于《食品安全国家标准 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中对各类食品的限量要求。梁营芳报道水中重金属的检测案例，这些方法在乳制品中的灵敏度是否会因乳制品复杂的基体而大打折扣，还有待进一步的研究验证。对于部分没有拉曼信号或拉曼信号很弱的物质，如亚硝酸根，需要对其进行衍生化，转化为具有拉曼信号的物质后再用SERS进行检测[23]。陈泳等[5]建立了衍生化-富集-表面增强拉曼光谱法，快速检测乳粉中亚硝酸盐，根据不同批次处理量发现单个样品检测全过程只需3～15 min，定性检测限为0.4 mg/kg，远低于国家安全标准对亚硝酸盐的限量要求(2 mg/kg)，证明利用拉曼快检手段检测乳粉中亚硝酸盐完全可行。苯并芘作为强致癌物质，是油脂质量的一个重要检测指标，国家标准限定油脂及其制品(含乳制品的乳油)含量不得超过10 μg/kg，钱立[24]用胶体金作为基底，并优化油脂中苯并芘的快速检测的前处理方法，所建立的方法检测限可达5 μg/L，线性范围在0～100 μg/L，相关线性系数可达0.99，验证了苯并芘利用拉曼快检手段的可行性。总体看来，利用拉曼技术实现乳制品主要污染物的快检可行性较强。

4 食品添加剂检测

食品添加剂是为改善食品品质和色香味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或天然物质。不同于违禁添加物，食品添加剂可以在允许的限量范围内使用。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)规定，不同的食品细类允许的添加剂最大使用量各不相同，如阿斯巴甜在乳制品中的最大使用量分为调制乳、风味发酵乳、调制乳粉和调制乳油粉、稀乳油和干酪等多个细类，每个细类的规定用量并不相同，这对定量检测提出了挑战。

目前，拉曼快检的成熟应用场景多数还停留在定性检测上，在实际定量分析过程中，仍存在再现性欠佳、信号易受实验测试条件和基底干扰等因素的影响，其定量分析技术仍亟待提高和完善[25]。目前，关于乳制品中食品添加剂的拉曼快检应用鲜有报道，宣芳等[26]对SERS技术在食品添加剂检测方面的应用进展做出了系统性的总结和概况，文中报道的研究无一涉及乳制品，研究实例中提到的技术指标也多数限于讨论检出限。该文也指出了拉曼快检技术在添加剂领域的应用还需要提升的几个方面[26]：①优化活性基底，实现标准化和商业化;②探讨如何去除或减少荧光效应;③提升方法的稳定性和重现性。由此可见，将拉曼快检推广到乳制品的添加剂领域，需要先跨越拉曼快检技术本身定量还不够成熟稳定的技术屏障。

5 非法添加物检测

对非法添加物而言，检测方法只需要满足检出限低于相关法规规定的限量值，即可实现应用前提。如三聚氰胺在婴儿配方食品中的限量规定为1 mg/kg，若拉曼快检方法的检出限能稳定低于1 mg/kg，就有一定的可行性。鉴于三聚氰胺事件的深远影响力，该项目的拉曼快检研究在我国得以高度的聚焦，研究人员尝试从前处理技术、纳米探针、SERS基底等多个方面进行方法改进，不断提高灵敏度。DONG等[27]用适体修饰的SERS纳米传感器和寡核苷酸芯片建立的纳米探针检测牛乳中的三聚氰胺，检测限达到了1 pg/mL。王琳等[28]用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备胶体金溶液作为SERS的增强试剂，检测限为1 μg/mL，样品前处理与检测时间一共只需15 min，可以采用手持式或便携式拉曼光谱仪，非常适合现场快检。相比之下，王琳的方法不仅仅检测限远低于限量规定，材料制作成本低于DONG的方法，检测快速，甚至可以采用手持式拉曼检测，显然比DONG的方法更有应用前景。乳粉由于基体成分的复杂，需要先使用固相萃取方法对目标物进行净化和富集，再进行SERS检测。雷皓宇等[29]使用三氯乙酸提取乳粉中三聚氰胺，用中性氧化铝进行分散固相萃取后上机检测，检出限为0.075 mg/kg，回收率为79.5%～124.0%，小于8.8%，检测时间约20 min。黄鹏程[7]采用三氯乙酸提取，阳离子固相萃取柱净化及富集的方法检测婴儿配方乳粉中三聚氰胺，检测限为0.1 mg/kg，回收率为96.1%～103.6%，小于7%，检测时间约20 min。相比之下，雷皓宇方法检出限略低于黄鹏程方法，后者在回收率和指标略有优势，但固相萃取的成本和操作难度高于分散固相萃取，综合评价，雷皓宇的方法更为推荐。

近年来，乳制品中的硫氰酸根问题也逐渐成为监管的关注点。国际食品法典委员会(CAC)允许硫氰酸钠在生乳中作为防腐剂，规定添加量为14 mg/kg。2008年，我国政府明令禁止将硫氰酸盐作为牛乳或其他食品的添加剂[30]，由于乳品中存在本底值，将液态乳品中硫氰酸钠的风险监测参考值确定为10 mg/kg。陈小曼等[30]采用三氯乙酸提取目标物，C18硅胶净化后使用便携式拉曼上机，检出限为7.5 mg/kg，回收率在70.5%～109%，小于9.8%，检测时间约15 min，方法简便快捷，有较好的应用前景。

6 结语

食品安全快检技术作为政府部门开展监督抽检和风险监测的检测手段之一，其检测结论目前并不允许作为执法依据，快检手段检出的不合格样品或阳性样品，必须采用实验室标准方法进行确认。快检技术的真正优势体现在可移动、易操作、耗时短和定性准确几个方面，因此，将拉曼技术应用于乳制品快检，这几个方面应成为主要的考量因素。综合上文分析，本文做出如下总结。①在乳制品掺伪鉴别方面，拉曼技术通过结合化学计量运算和交叉验证方法对于乳粉的原产地(品牌)鉴别具有一定的应用前景，但仍需解决前处理繁杂耗时的问题，而对于不同动物源的奶粉掺伪鉴别，相比生物化学方法，没有优势。②在药物残留方面，拉曼快检技术的应用开发应扬长避短，发挥拉曼探针和基底多样性的特点，将研究方向瞄准安全问题突出，而其他快检技术还难以攻克的项目。③在污染物方面，SERS技术有着比较好的应用前景，尤其是重金属类，在检测水质方面表现出极高的灵敏度，应开展更多研究论证SERS技术在开展乳制品中重金属快检的可行性。④在食品添加剂方面，可以尝试先在规定限量一致的项目进行突破，比如乳制品中的一些人工合成着色剂(日落黄、柠檬黄、亮蓝等)，对于细类规定限量不一致的项目，还需先解决定量精确度和重现性的问题。⑤在非法添加物方面，将拉曼技术应用于三聚氰胺和硫氰酸钠快检具备可行性，还需要改进的问题是如何选用更经济的材料、耗材以及提高检测时效。综上所述，拉曼光谱，尤其是SERS技术的突出优势在于专属特异性强，短板在于纳米探针和基底的多样性导致的开发和制作成本较高，应综合考虑实际应用需求、经济成本以及可实操性多个维度，把握好研究方向。

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基金项目: 海关总署科研项目(2019HK120)。

通信作者：花锦(1986—)，女，汉族，山西交城人，硕士，高级工程师。研究方向：食品、环境与化妆品安全。