串联质谱法快速测定养殖鱼中的乙氧基喹啉

　　QuEChERS提取一EMR净化-高效液相色谱一

　　

　　串联质谱法快速测定养殖鱼中的乙氧基喹啉

　　

　　陈琳珊 12陈佩佩 1，2，何雯倩1.3，陈 茹1.3

　　

　　（1.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442;2.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442;

　　

　　3.广东省质量监督食品检验站，广东广州 511442）

　　

　　作者简介∶陈琳珊（1987—），女，汉族，广东台山人，大专，助理工程师。研究方向∶食品分析检测。

　　

　　摘 要∶建立了高效液相色谱-串联质谱法对养殖鱼中的乙氧基喹啉进行快速测定。基于QuEChERS技术，样品用乙腈和水提取，盐析分层离心。经增强型基质去除固相吸附剂（（Enhanced Matrix Removal，EMR）净化后，通过电喷雾电离源（Electrospray Source Ionization，ESI）的正离子模式电离，结合多反应监测（Multiple Response Monitoring，MRM）进行采集。乙氧基喹啉标准曲线在1.0～200 μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数r>0.999 6，平均回收率为82.9??105.0??方法检出限为10.0 μg/kg，方法定量限为 30.0 ug/kg，相对标准偏差RSDs为4. 64% ~ 5. 96%。该方法简单快捷，回收率良好、灵敏度高和重现性好，可应用于实际养殖鱼中乙氧基喹啉的快速测定。

　　

　　关键词∶超高效液相色谱-串联质谱法;快速测定;水产品;乙氧基喹啉

　　

　　乙氧基哇咻(Ethoxyquin, EQ)是一种经化学合成的芳香 胺，结构如图1所示，呈油状液体，具有清除自由基从而防 止脂质氧化的作用，同时对蛋白质、维生素等物质也有很好 的抗氧化效果E,因此在饲料产品市场中应用广泛。有研究 表明，一定量的乙氧基哇琳对大黄鱼、雏鸡具有一定的促生 长作用，但过量时会产生抑制生长的作用同时，过量的 乙氧基哇琳会对动物机体产生_定的不良影响，如400 mg/kg 的饲料添加量会使大菱衅降低食量[4],而15 000 mg/kg的添 加量也会使大西洋鍵产生拒食现象按照欧盟规定，2018 年3月31日后不允许饲料产品中有乙氧基哇咻产品添加， 可见乙氧基喳琳的安全性确实存在一定的争议，而人类作为 水产品的终端消费者，乙氧基喳琳在水产品中的残留量也会 对人体存在一定的隐患。目前，我国的相关法律法规仍然允 许乙氧基哇琳在饲料中添加使用，由于其效果优异，即使我 国水产品行业禁用后，仍然有可能会存在一段时间的违法滥 用。因此，建立水产品中乙氧基哇哧快速有效的检测方法具 有极其重要的意义。

　　

　　目前，对水产品中乙氧基喳琳测定方法的相关报道较少, 主要为毛细管电泳法时、高效液相色谱法卩％气相色谱法㈣、 液相色谱串联质谱法网、气相色谱-质谱法凹和高分辨质 谱法回。毛细管电泳法灵敏度高、重现性差，高效液相色 谱法和气相色谱法则存在选择性较低的问题，高分辨质谱法 价格昂贵，仪器维护成本高，难以普及，因此这些方法均难 以应用于实际的大批量检测。而液相色谱串联质谱法、气相 色谱-质谱法则具有灵敏度高，选择性好，应用广泛的优点, 可用于实际的批量检测。本文建立的高效液相色谱-串联质 谱法，基于QuEChERS方法提取，增强型基质去除净化剂 EMR进行净化，通过二次优化质谱参数，使目标物达到实 际测定的最佳响应值，结合高效液相色谱，使目标物在短时 间内出峰，且保持良好的峰型。同时方法学实验数据表明， 该方法可有效测定水产品中的乙氧基喳琳。

　　

　　1材料与试剂

　　

　　1.1仪器与设备

　　

　　高效液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾电离源 (ESI) (API 4000Q, ABSCIEX 公司)；电子天平；4kT5 离心机(北京卓明贸易有限公司)；IKAM)rtex4涡旋混匀器 (广州仪科实验室技术有限公司)；Milli-Q去离子水发生器 (美国Millipore公司)。

　　

　　1.2材料与试剂

　　

　　养殖鱼样品，购于广州市市场。

　　

　　甲酸、乙睛(LC-MS级，美国Thermo Fisher公司)； 乙氧基喳咻标准品(纯度>98.5%, SIGMA,购自安谱公司)； EMR净化管(安捷伦，购自德祥公司)；石墨化炭黑键合硅 胶(Graphitizing of Carbon Black. GCB)、十八烷基键合硅 胶(CQ、N-丙基乙二胺键合硅胶(Primary Secondary Amine, PSA)(购自广州联方公司)；无水硫酸镁、氯化钠(分析纯, 购自安谱公司)。

　　

　　1.3实验条件

　　

　　1.3.1标准溶液的配制

　　

　　标准溶液：称取适量标准品，用乙睛溶解并配成浓度为 1 mg/mL的标准储备溶液，于4 P下避光保存。

　　

　　标准工作溶液：分别准确移取一定体积的标准储备

　　

　　液，用乙腊重新定容成1.0 Hg/L、2.0 ng/L、5.0 ng/L、 20.0 pg/L, 50.0 gg/L> 100.0 p.g/L和 200.0 gg/L 的标准工作液。 1.3.2样品处理

　　

　　养殖鱼产品先均质处理。称取均质后样品2.0 g(精确至 0.01 g),精密称定于50 mL离心管中，先加入水lOmL, 再加入乙腊10 mL,涡旋混合2 min,然后加入4 g无水硫 酸镁和lg氯化钠，涡旋提取15 min, 10 000 r/rnin离心 5 min,离心后取2 mL上清液转移至15 mL EMR脱脂净化 管(预先用1 mL水活化2min)中，涡旋2min后，4 500r/min 离心5 min,取1.5 mL上清液于装有0.5 g无水硫酸镁的 2 mL离心管中脱水后过膜上机。

　　

　　1.3.3色谱条件

　　

　　色谱柱 Agilentporoshell EC-C18 (150 mm><3.0 mm, 2.7 pm)； 柱温为40P；进样量为10pL；流动相A为乙睛，B为0.1%甲酸水(体积分数)；釆用等度洗脱方式洗脱分离：A ： B为80 : 20；流速为 0.40 mL/min；釆集时间：7 min.

　　

　　1.3.4质谱条件

　　

　　离子源：电喷雾电离源(ESI)；电离模式：正离子模 式；离子源温度为500 °C,离子源电压为5 000 V。雾化气 (GAS1) : 50 psi；加热辅助气(GAS2) : 50 psi；碰撞气 (CAD) : medium；釆集模式：多反应监测(MRM)模式。

　　

　　2结果与分析

　　

　　2.1质谱分析条件的确定

　　

　　建立养殖鱼中乙氧基喳琳的仪器分析方法，通过流动注 射的方式，将标准溶液直接注入ESI离子源，确定乙氧基哇 咻的母离子质荷比为m/z 218.3,子离子质荷比分别为mlz 148.2 和油174.2,同时优化其去簇电压DP和碰撞能量CE,得 到最佳的参数条件，见表1。通过优化色谱条件，确定最佳 洗脱流动相比例为乙腊：0.1%甲酸水(80 : 20),流速为 0.40mL/mm»乙氧基哇咻标准品提取离子流色谱图如图2所示。

　　

　　2.2分散固相萃取剂类型的选择

　　

　　在实验初期，探究了分散固相莘取剂类型对乙氧基喳琳 回收率的影响。由于购买的EMR净化管中包含了 l.lg的 EMR净化粉末，为了保证方法的简便性，不再对用量进行探究，同时，用同样量的PSA、C”和GCB净化粉末进行回收 率的对比。分别对每个用量水平重复测定6次，以平均回收 率为考察依据。结果显示，当用EMR净化时，乙氧基喳琳 的回收率最高。而且水产品中含有较多的油脂，用EMR净 化能降低仪器分析时的基质效应。因此，最终选择EMR为 净化剂。结果详见图3。

　　

　　2.3基质效应

　　

　　养殖鱼中基质复杂，对目标物可能存在基质效应，从而 影响目标物在质谱中的离子化程度，因此对乙氧基喳琳的基 质效应(matrix effect, ME)进行了考察。按照前处理方法对 乙氧基喳琳呈阴性的罗非鱼进行处理，得到空白基质液，用 此空白基质液配制50 ng/L的单标溶液，按方法的仪器条件 测试，测得值和原浓度比值即为梃,以她作为判断的依据。 当Affi值在0.8〜1.2时，基质效应不明显；若Affi值小于0.8, 则说明基质效应为强负效应明显，大于1.2则为强正效应。 乙氧基喳琳的她计算结果为0.92,说明基质效应不明显， 这可能是由于EMR净化了样品中大部分的油脂。因此，为 了简化实验，最终釆用溶剂曲线作为定量曲线。

　　

　　2.4线性关系和检出限

　　

　　在本方法所确定的实验条件下，用乙腊将标准溶液稀释 至 1.0 fig/L、2.0 jig/L、5.0 ng/L, 20.0 pg/L, 50.0 fig/L、100.0 gg/L 和200.0 gg/L进行测定，以峰面积(Y轴)对相应的浓度(X轴) 作图，得到线性方程JM.76xl0%3.92xl()3。结果表明，待测 化合物浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数r为0.999 6,具有较准确定量能力。

　　

　　同时，通过对罗非鱼样品进行低浓度水平加标，再分别按信噪比的3倍(S//3)和10倍(S/AM0),得出方法检出 限(LOD)和定量限(AOQ)。结果表明，乙氧基喳咻的方法检 出限为10.0ng/kg,定量限为30.0pig/kg,表明方法具有较 高的灵敏度。

　　

　　2.5回收率与精密度实验

　　

　　选取均质后的样品初步平均测定3次，确定其本底值， 再进行加标回收实验，结果见表3。最终选用乙氧基哇琳 呈阴性的罗非鱼和黄鳍作为加标回收样品，按照乙氧基喳 琳定量限的1倍、2倍和5倍水平进行添加，每一个水平 均进行日内重复测定6次(»=6)«最终测得平均回收率在82.9%〜105%,相对标准偏差71SD为4.64%〜5.96%。结果表明，方法回收率良好，精密度好，满足实验室的测定要求。

　　

　　3 结论 in the muscle of Atlantic salmon (Salmo salarL.)[J]. Food Chem

　　

　　本文基于QuEChERS技术对样品进行提取，选用增强 Toxicol, 2008,46(5):1834-1843.

　　

　　型基质去除 EMR 粉末进行分散固相萃取净化。建立的超高 【6】庞军，刘文红，宋合兴，等.高效毛细管电泳法同时检

　　

　　效液相色谱条件使目标物在3 min 内出峰，且峰型良好。通 测饲料中六种抗氧化剂 【J】.中国饲料，2013（8））∶40-42.

　　

　　过流动注射混合流动相的方式，二次优化目标物的质谱参 【7】余晓琴，李澍才，唐昌云.高效液相色谱-荧光检测法

　　

　　数，提高了目标物的灵敏度。通过方法学实验验证了方法的 测定水果中乙氧基喹啉【J】.分析测试学报，2019.38（10）∶1260-1264.

　　

　　可行性，结果表明，该方法回收率良好，灵敏度高，重复性 【8】舒晓梦，赵素娟，王羚佳，等.高效液相荧光法测定猪

　　

　　好。在实际的样品测定实验中，能有效检测出实际阳性样品， 肉中抗氧化剂乙氧基喹啉以及代谢产物二聚乙氧基喹啉【J】.食

　　

　　因此，可应用于日常实验室的检测中，同时也为后续的相关 品与发酵工业，2018，44（5）∶244-248.

　　

　　研究提供了参考依据。 [9]RODRiGUEZ-GOMEZ R, VANDEPUT M,ZAFRA-

　　

　　参考文献 GOMEZ A,et al. Liquid chromatography-electrochemical detection

　　

　　[1]PRYOR WA,STRICKLAND T,CHURCHDF.Comparison for the determination of ethoxyquin and its dimer in pear skin and

　　

　　of the efficiencies of several natural and synthetic antioxidants in salmon samples[J].Talanta, 2018, 177(1):157-162.

　　

　　aqueous SDS [sodium dodecylsulfate] micelle solutions[J]. Joumnal of 10】董茂锋，白冰，饶钦雄，等.气相色谱法测定饲料中

　　

　　the American Chemical Society, 198,110(7):224-229. BHT和EQ两种抗氧化添加剂【J】.中国饲料，2012（8）∶40-42.

　　

　　[2]OHSHIMA M,LAYUG D,YOKOTA H,et al.Effect of [11]KRANAWETVOGL A,ELSINGHORST P W.

　　

　　graded levels of ethoxyquin in alfalfa leaf extracts oncarotenoid Determination of the Synthetic Antioxidant Ethoxyquin and

　　

　　and cholesterol concentrations in chicks[J].Animal Feed Science & Its Metabolites in Fish and Fishery Products Using Liquid

　　

　　Technology, 1996,62(2/3/4):141-150. Chromatography-Fluorescence Detection and Stable-Isotope Dilution

　　

　　【3】 王曙.乙氧基喹啉，氧化鱼油和烟酸铬对大黄鱼与鲈 Analysis-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J.J

　　

　　鱼生长性能的影响及其（或代谢物）在鱼体组织中残留的研究 Agr Food Chem, 2019,67(23):6650-6657.

　　

　　【D】.青岛∶中国海洋大学，2010. [12]CHEN A D,WU Z W,YU Q,et al. Simultaneous

　　

　　[4]SAXENA T B,ZACHARIASSEN K E,JORGENSEN determination of 31 preservatives and antioxidants in liquid

　　

　　L. Effects of ethoxyquin on the blood composition of turbot, preparation and healthcare dietetic liquid by GC/MS[J].Journal of

　　

　　Scophthalmus maximus L.[J]. Comp Biochem Phys C: Pharmacology, Chinese Mass Spectrometry Society,2014,35(5):438446.

　　

　　Toxicology and Endocrinology,2000,127(1):1-9. 【【13】郭思言，丁涛，殷耀，等.高效液相色谱-四极杆/静

　　

　　[5]BERDIKOVA-BOHNEVJ,LUNDEBYEAK,HAMRE K. 电场轨道阱高分辨质谱对水产品中未知污染物的非定向快速

　　

　　Accumulation and depuration of the synthetic antioxidant ethoxyquin 筛查与测定【J】.色谱，2019.37（1）∶15-20.