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食品中金黄色葡萄球菌检测能力验证的结果与分析

2021-08-15 17:40:46 来源:

　　食品中金黄色葡萄球菌检测能力
　　
　　验证的结果与分析
　　
　　董慧明
　　
　　（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110036））
　　
　　摘 要∶为提高微生物实验室金黄色葡萄球菌的检测能力，于2020年参加乳粉中金黄色葡萄球定量检测能力验证，依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB4789.10—2016）进行检验。同时应用科玛喜金黄色葡萄球菌显色平板和 3M金黄色葡萄球菌测试片作为对照手段进行实验，并应用VITEK2进行生化鉴定，确保实验结果的准确性。结果表明，样品CODE TF02490061结果报告为1 100 CFU/g、样品CODE TF02490062结果报告为4 800 CFU/g，反馈结果为满意，z值均<2。
　　
　　关键词∶金黄色葡萄球菌;能力验证;平板计数
　　
　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种食源性 病原菌，为无芽苑、无鞭毛的革兰氏阳性球菌。金黄色葡萄 球菌是食品致病菌污染主要的病原菌，其产生的肠毒素可引 起食物中毒，导致腹泻和上呼吸道感染叫该菌也可以引起 局部化脓炎症感染、肺炎、心包炎等，甚至导致败血症、脓 毒症等全身感染㈣。
　　
　　能力验证活动是利用实验室间的比对，按照预先制定的 准则评价参加者的能力[3]o为有效提高实验室检测水平和人 员技术能力，辽宁省检验检测认证中心于2020年参加了中 国食品药品检定研究院组织的乳粉中金黄色葡萄球菌定量 检测（NIFDC-PT-249）能力验证。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1样品
　　
　　待测能力验证样品为两件，每件样品由1个菌球及 相应奶粉组成，编码分别为CODE TF0249006K CODE TF02490062o在生物安全柜内将金黄色葡萄球菌样品的西 林瓶打开，将西林瓶内小球加入到225 mL无菌生理盐水稀 释液中，充分溶解，然后再将与西林瓶相同编码的奶粉样品 加入到上述稀释液中，充分均质混勾。依此方法，分别对2 件样品进行处理。
　　
　　1.2试剂和仪器
　　
　　金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538及表皮葡萄球菌 标准菌株ATCC12228,购自广东环凯微生物有限公司； Baird-Parker平板（B-P平板）、0.85%无菌生理盐水、平 板计数琼脂（PCA）、革兰氏染色液、脑心浸出液肉汤（BHI）, 均购自北京陆桥技术股份有限公司；冻干兔血（美国BD公 司）；浆金黄色葡萄球菌显色平板（法国科玛嘉公司）；金 黄色葡萄球菌测试片（美国3M公司）；革兰氏阳性细菌鉴 定卡（GP卡）（法国梅里埃公司）。
　　
　　A2型生物安全柜（美国NUAIRE公司）；电热恒温培 养箱（德国Binder公司）；生物显微镜（日本奥林帕斯公司）； 高压灭菌锅（日本Tomy公司）；均质器（法国梅里埃公司）； VITEK2全自动微生物生化鉴定系统（法国梅里埃公司）。
　　
　　1.3方法
　　
　　依据作业指导书及《食品安全国家标准食品微生物学 检验金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016） [4]第二 法平板计数法进行检测。同时用科玛嘉金葡显色平板和金葡 测试片作为对照手段进行实验，金葡显色平板每皿接种量为 0.1 mL, 3M金葡测试片每片接种量为1 mL。
　　
　　2结果与分析
　　
　　2.1典型菌落计数
　　
　　金黄色葡萄球菌在B-P平板上呈圆形，表面光滑、凸起、 湿润、菌落直径为2〜3 mm,颜色灰黑至黑色，有光泽， 周围有不透明圈（沉淀环），其外有一透明圈（卵磷脂环）， 菌落有黄油样粘稠感；在金葡显色培养基上显紫红色，其他 菌显蓝绿色或无色；在3M金葡测试片上为紫红色点，需要 确认片进行确认。典型菌落特征见图1。
　　
　　选择同一稀释度所有典型菌落数合计在20〜200 CFU 的平板，计数典型菌落数。金黄色葡萄球菌3种计数方法结 果见表1,可见3种方法结果无明显差异，3个结果都在同 一数量级上。

　　2.2确证试验(鉴定)
　　
　　从 CODETF02490061 和 CODE TF02490062 适宜稀释度 的B-P平板典型菌落中选取5个菌落，分别做革兰氏染色 镜检和血浆凝固酶试验，并应用VITEK2进行生化鉴定，确 保实验结果的准确性。
　　
　　2.2.1染色镜检
　　
　　取典型菌落进行革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阳性球 菌，直径为0.5〜1.0呻，显微镜下排列成葡萄串状排列。 2.2.2血浆凝固酶试验
　　
　　挑取B-P平板上典型菌落5个，进行血浆凝固酶试验， 同时以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538和表皮葡萄球 菌ATCC12228的肉汤培养物作对照，典型菌落和阳性菌株 对照血浆凝固酶试验均在2h产生凝固，阴性菌株对照菌株 观察6 h不产生凝固。典型菌落均为血浆凝固酶阳性，阳性 比例为100%。
　　
　　2.2.3 VITEK2生化鉴定
　　
　　将挑取B-P平板上典型菌落划线接种至PCA平板,36 °C 培养24h,取新鲜培养的菌落进行VITEK2生化仪器鉴定， 鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，说明B-P平板对金黄色葡 萄球菌的选择性非常好，特征明显能够明确区别于其他葡萄 球菌。
　　
　　2.3结果报告及反馈
　　
　　以国家标准方法结果为本次能力验证的报告结果，即证 实为金黄色葡萄球菌菌落阳性比例乘以相应稀释度B-P平 板计数典型菌落数，再乘以稀释倍数，为样品中金黄色葡萄 球菌结果报告数，单位为CFU/g。编号CODE TF02490061 样品结果报告为1 100 CFU/g,编号CODE TF02490062样 品结果报告为4 800 CFU/g。
　　
　　经能力验证组织机构反馈，本实验室CODE TF02490061 金黄色葡萄球菌的检测结果为3.041,指定值为3.176, z值 为-0.5； CODE TF02490062金黄色葡萄球菌的检测结果为 3.681,指定值为3.712, z值为-0.1； z值均<2,两个样品 的结果评价为满意。
　　
　　3结论与讨论
　　
　　本能力验证中釆用多种方法同步进行金黄色葡萄球菌 检测，以保证实验室检测结果的准确性。3种计数方法结果 无明显差异，3个结果均在同一数量级上，说明实验准确无 误，B-P平板与金葡显色平板计数结果相近，而3M金葡测 试片计数结果略低。金葡测试片中相对营养成分较少，且含 有抑制其他菌生长的物质明故其检测结果略低。最后的结 果报告以B-P平板上菌落数为主，金葡显色平板和3M金 葡测试片上的菌落数为参考，经反馈两个样品的结果评价为 满意。
　　
　　金黄色葡萄球菌检测的关键控制点，①在实验前将B-P 平板提前放在培养箱中，使平板表面干燥。涂布时用L棒 小心涂匀，注意不要触及平板边缘，涂布后先正置培养，保 证水分完全吸收后再倒置培养，以免细菌在平板边缘缝隙生 长，影响观察计数。②进行血浆凝固酶试验时，以金黄色葡 萄球菌标准菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的 肉汤培养物作对照，典型菌落和阳性菌株对照血浆凝固酶试 验应在6h内产生凝固，阴性菌株对照菌株观察6h不产生 凝固，以确保血浆凝固酶试验准确。
　　
　　参考文献
　　
　　[1]曾博雅.食品微生物金黄色葡萄球菌定量检测能力验 证[J],现代食品 >2020(11):176-177.
　　
　　[2]刘云国.食品卫生微生物学标准鉴定图谱[M].北京： 科学出版社,2009.
　　
　　[3]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则:CNAS- RL02:2018[S].北京：中国标准出版社2018.
　　
　　[4]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委 员会.食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌 检验:GB 4789.10—2016[S].北京：中国标准出版社,2016.
　　
　　[5]范田丽，付晓静，吴海江.金黄色葡萄球菌定量检测能 力验证结果与分析[J],现代食品,2020(3):196-198.
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