不同水解时间对乳与乳制品中糠氨酸含量的影响

孙玉荣，胡冬梅*，刘 静，杨文志，王玉珏，江云鹏

(蒙牛乳业(察北)有限公司 河北省张家口市张北县察北管理区，河北张家口 076481)

摘 要：目的：探究水解时间对乳与乳制品中糠氨酸含量测定的影响。方法：在75 ℃、30 min及75 ℃、15 s杀菌条件下测定不同水解时间下乳与乳制品中的糠氨酸含量，探究其重复性与稳定性。结果：在75 ℃、30 min条件下，随着水解时间的增加，乳与乳制品中糠氨酸含量有所增加。当水解时间为9.0 h，乳与乳制品中的糠氨酸含量达到最高，之后缓慢降低。乳与乳制品中的糠氨酸含量的加标回收率均>90%，相对标准偏差<6%。结论：不同水解时间会影响到乳与乳制品中的糠氨酸含量。

关键词：糖氨酸;水解时间;检测方法

Effect of Different Hydrolysis Time on Determination of Furosine Content in Milk and Dairy Products

SUN Yurong, HU Dongmei*, LIU Jing, YANG Wenzhi, WANG Yujue, JIANG Yunpeng

(Mengniu Dairy (Chabei) Co., Ltd., Chabei Administrative District Zhangbei County, Hebei Province, Zhangjiakou 076481, China)

Abstract: Objective: To explore the effect of hydrolysis time on the determination of furosine content in milk and dairy products. Method: Determine the content of furosine in milk and dairy products under the conditions of

75 ℃, 30 min and 75 ℃, 15 s under different hydrolysis time, and explore its repeatability and stability. Results: Under the condition of 75 ℃ and 30 min, with the increase of hydrolysis time, the content of furosine in milk and dairy products increased. When the hydrolysis time was 9.0 h, the content of furosine in milk and dairy products reached the highest, and then slowly decreased. The recovery rates of the addition of furosine content in milk and dairy products were both >90%, and the relative standard deviation was <6%. Conclusion: Different hydrolysis time will affect the content of furosine in milk and dairy products.

Keywords: glycine; hydrolysis time; detection method

糠氨酸是牛乳在加热过程中，氨基酸、蛋白质与乳糖通过美拉德反应生成ε-N-脱氧乳果糖基-L-赖氨酸(ε-N-deoxylactolusy-L-lysine)，经酸水解转换成更稳定的糠氨酸(ε-N-2-furoylmethyl-L-lysine，ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸)[1]。这个反应的大小程度与生乳在灭菌过程中热处理的类型与强度有着密切的联系，与成品液态奶品质的优良息息相关。

《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》(NY/T 939—2016)中糠氨酸含量的测定：试样经盐酸水解后测定蛋白质含量，水解液经稀释后用高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)在紫外(波长280 nm)检测器下进行分析，外标法定量[2]。基于水解时间要求(110±2)℃下加热水解12～23 h。

因耗时较长的原因，本文分析研究水解1～13 h的糠氨酸的回收率，并进行回收率试验，对比分析1～13 h的糠氨酸检测数据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

甲醇(CH3OH)：色谱纯;浓盐酸(HCL，密度为1.19 g/mL);三氟乙酸：色谱纯;乙酸铵;糠氨酸(C12H17N2O4·XHCL);水相滤膜;水相针头式滤器;1 mL注射器。

1.2 仪器

配有紫外检测器的高效液相色谱仪;(110±2)℃干燥箱;密封耐热试管：容积为20 mL;电子天平：感量为0.1 mg;凯氏定氮仪。

1.3 试验方法

1.3.1 采样

用于检测的巴氏杀菌乳在储存和运输过程中的温度为2～6 ℃，UHT灭菌乳储存和运输温度不高于25 ℃。按《随机数的产生及其在产品质量抽样检验中的应用程序》(GB/T 10111—2008)的规定取不少于250 mL样品，样品在送检过程中应完好无损且样品储存环境条件符合要求。

1.3.2 试样水解液的制备

吸取2.00 mL试样，置于密闭耐热试管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L盐酸溶液，混匀。密闭试管，置于干燥箱中，在110 ℃下加热水解1～13 h，加热约1 h后，轻轻摇动试管。在加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后用滤纸过滤，滤液供测定[2]。

1.3.3 试样水解液中蛋白质含量的测定

移取2.00 mL试样水解液，按《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2016)的规定测定试样溶液中的蛋白质含量[3]。

1.3.4 糠氨酸含量的测定原理

试样经盐酸水解后测定蛋白质含量，水解液经稀释后用高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)在紫外(波长280 nm)检测器下进行分析，外标法定量。

1.3.5 试样水解液中糠氨酸含量测定

移取1.00 mL试样水解液，加入5.00 mL的6 g/L乙酸铵溶液，混匀，过0.22 μm水相滤膜，滤液供上机测定。

1.3.6 HPLC测定

(1)色谱参考条件。色谱柱：CAPCELL PAK C18 TYPE：AQ 250 mm×4.6 mm，5 μm粒径;柱温：32 ℃;流动相：0.1%三氟乙酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B;洗脱梯度，见表1。

(2)糠氨酸含量测定。利用流动相A和流动相B的混合液(50∶50)以1 mL/min的流速平衡色谱系统。然后，用初始流动相平衡系统直至基线平稳。空白试剂为10 µL盐酸溶液(浓度3 mol/L)，选择10 μL待测溶液对糠氨酸含量进行测量。

其 中：X- 试 样 中 蛋 白 质 的 含 量，g/100 g; V1- 试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL;V2-试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL;C- 硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L;0.014 0-1.0 mL硫酸[(c ½H2SO4)=1.000 mol/L]或盐酸[(c HCl)=1.000 mol/L] 标准滴定溶液相当的氮的质量，g;m- 试样的质量，g;V3- 吸取消化液的体积，mL;F- 氮换算为蛋白质的系数，各种食品中氮转换系数;100- 换算系数。

(4)糠氨酸含量的计算。糠氨酸含量以质量分数计，数值以毫克每百克蛋白质(mg/100 g蛋白质)表示，糠氨酸含量的计算如(2)所示：

2 结果与分析

2.1 样品中糖氨酸含量(mg/100 g蛋白质)

标样的浓度为2 mg/L，以标样的峰面积为仪器采集数据，对样品中糖氨酸的含量进行计算。样品在乳糖酶作用下，牛乳水解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h，采用HPLC法对牛乳中糠氨酸含量进行测量。作为MailIard反应产生的特定产物，糠氨酸近年来常常被用于食品受热程度的判断与评估，主要应用在谷物、蛋类、肉制品及中药口服液中。由表2可知，随着乳糖酶水解时间的延长，乳与乳制品中糠氨酸含量呈现升高趋势。经过75 ℃、30 min及75 ℃、15 s预杀菌处理条件下，可以发现其前者较后者所获得的糠氨酸含量成倍升高。按照《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》要求，其中的糠氨酸含量>12 mg/100 g蛋白质或UHT乳中糠氨酸含量>190 mg/100 g 蛋白质，表示含有复原乳。当水解时间达到9 h后，乳与乳制品中糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白质，随着水解时间的延长，糠氨酸含量逐渐降低。乳与乳制品经过75 ℃、15 s热处理，糠氨酸含量较低，相当于有复原乳的巴氏杀菌乳。

2.2 加标回收率试验

在已知糠氨酸含量供试验品中加入一定量标准样品，反复进行5次测定，结果如表3所示。

由表3可知，其回收率均在90%以上。按照公式计算相对标准偏差，结果为：

3 结论

本文对《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》分析步骤中的试样水解液的制备[3-4]，水解时间在9 h的糠氨酸含量回收率进行分析论证得到，样品的回收率结果符合回收率要求90%～110%(高效液相色谱法测定复原乳中糠氨酸的含量回收率试验)[5]，相对标准偏差为5.68，符合独立测试结果<10%的要求。随着乳糖水解时间的延长，乳与乳制品中糠氨酸含量呈现出升高趋势，当水解时间为9 h且经过75 ℃、30 min热处理，糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白质，乳与乳制品相当于含有复原乳的UHT杀菌乳，在75 ℃、15 s条件下，乳与乳制品获得糠氨酸含量少，仅为含有复原乳的巴氏杀菌乳。按照《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》制备试样水解液，将水解时间控制为9 h，获得的糠氨酸含量最高，且具有较高的回收率，标准偏差<10，故可应用于实际的检测工作中，节约人工成本、提高工作效率。

参考文献

[1]许国庆,赵慧芬,李克杰,等.乳与乳制品中糠氨酸含量的测定方法[J].中国奶牛,2006(7):44-46.

[2]迟骁玮.乳品中糠氨酸定量分析及热处理对糠氨酸含量影响的研究[D].淄博:山东理工大学,2012.

[3]卢沛明,黄娟.乳制品中的糠氨酸测定方法的改进[J].食品科技2015,40(7):318-320.

[4]王峰恩,张养东,郑楠,等.奶及奶制品中糠氨酸检测方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(6):2304-2312.

[5]陈冲冲,郑楠,文芳,等.牛奶中糠氨酸检测方法的研究进展[J].中国乳品工业,2017,45(4):25-29.