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生姜蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达

2021-08-30 14:33:38 来源: 食品安全导刊

生姜蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达
卢 瑛
(莱芜职业技术学院,山东莱芜 271100)
基金项目:莱芜职业技术学院2015年度教师科研项目“生姜蛋白酶纯化工艺的开发”(2015jsky12)。
 
摘 要:提取莱芜生姜总RNA,采用RT-PCR技术扩增出生姜蛋白酶(Ginger protease)基因GP2和GP3,经序列比对,发现莱芜生姜蛋白酶基因GP2在945位的碱基与Gene bank中生姜蛋白酶的序列GP2b(GI:57118006)有差异,GP3在451、700和804这3个位置的碱基与GP3b(GI:57118011)有差异,在翻译后的氨基酸也不同,表明了不同生姜品种生姜蛋白酶基因的多样性。将克隆的GP2片段GPII重组到带有His-tag的原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET-GPII。将重组pET-GPII转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌株,工程菌株用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,在诱导6 h,IPTG浓度为0.1 mmol/L时,重组GPII表达量最高。SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明蛋白大小约为21 kDa。该实验结果表明生姜蛋白酶能够在原核表达系统进行大量表达,为生姜蛋白酶工程化生产奠定了基础。
关键词:莱芜生姜;生姜蛋白酶;克隆;原核细胞;表达
 
生姜蛋白酶(Ginger protease/Zingibain,EC 3.4.22.67)是存在于生姜块状根茎中的一种巯基蛋白酶,有两种GP-I和GP-II(GPI和GPII分别与GenBank中GP3和GP2同源性较高),均含有221个氨基酸,含有6个Cys形成3个二硫键为糖蛋白,具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能够水解胶原蛋白,可用于肉类嫩化、酒类澄清,乳制品凝固等[1],以姜汁为添加剂开发的具有新型保健功能的凝固型酸奶,在广东地区颇受欢迎,因此该酶具有良好的工业化应用前景[2]。
生姜蛋白酶的分离纯化工艺操作复杂,而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品种、不同栽培地区及不同气候条件下差异非常大,甚至同一品种的干姜与生姜之间的含量也不相同,导致生姜蛋白酶的提取率不稳定[3]。尤其生姜常年连作导致茎腐病、斑点病和姜瘟病高发,推升了市场上生姜的价格,使得提取生姜蛋白酶的成本升高,进一步限制了生姜蛋白酶的开发利用。
本实验从莱芜生姜中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增生姜蛋白酶基因,并构建了pET-GPII原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌BL21中实现了原核表达,为生姜蛋白酶工程化生产进行了探索。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种、质粒和植物材料
大肠杆菌DHB4和宿主菌BL21以及质粒pET30a(+)为本实验室保存,莱芜生姜购于莱芜大润发超市。
1.1.2 酶、试剂盒和生化试剂
dNTP、DL2000、EasyTaq DNA聚合酶、TransStart FastPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;植物总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司;T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司;限制性内切酶KpnI、XbaI、EcoRI和反转录试剂盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit购自ThermoFisher公司;DNA凝胶回收试剂盒和DNA质粒提取试剂盒购自OMGEA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 生姜蛋白酶cDNA的合成
根据植物总RNA提取试剂盒操作说明分离提取生姜总RNA,将RNA利用反转录试剂盒合成cDNA并稀释至
50 ng/µL。
1.2.2 引物的设计与合成
根据Gen Bank(NCBI)数据库中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a(GI:57118005)和GP3a(GI:57118009)的上下游序列设计特异性引物,以生姜mRNA反转录产物(cDNA)为模板,PCR克隆生姜蛋白酶基因。两对特异性引物,分别为GP2a上游引物:5’-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTAGACAAT-3’,下游引物:5’-ATTAAAGCTTTGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’;GP3a上游引物:5’-ATTTGGATCCATGGCTTCCTTCGTCGC-3’,下游引物:5’-ATTAGTCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3’;GPII上游引物:5’-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3’,下游引物:5’-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’。
1.2.3 生姜蛋白酶原核表达载体的构建
以稀释后的cDNA为模板,PCR扩增生姜蛋白酶基因。PCR反应程序按照TransStart FastPfu DNA聚合酶说明书执行。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。将回收的PCR产物交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序,并与Gene Bank上已发布的序列进行比对。以GP2序列为模板克隆GPII片段,并连接到表达载体pET30a(+)载体上转化感受态DHB4,经Kan+抗性的LB固体培养基筛选。挑取抗性重组子测序,将序列正确的克隆命名为pET-GPII。提取重组质粒转化BL21感受态细胞。
1.2.4 生姜蛋白酶表达条件优化
将携带重组表达载体pET-GPII的工程菌BL21在LB培养基上培养至OD600为0.4时,分别加入0~0.5 mmol/L不同浓度的IPTG,37 ℃诱导4 h,并通过SDS电泳分析IPTG浓度对诱导结果的差异。进一步在加入0.1 mmol/L的IPTG条件下诱导0~10 h不等的时间,分析不同诱导时间对诱导结果的差异。
2 结果与分析
2.1 生姜蛋白酶基因的克隆与原核表达载体构建
通过RT-PCR成功获得与目的基因大小相符的DNA片段。将该片段连接到原核表达载体pET-30a(+)并进行测序,GP2序列全长为1 146 bp,GP3为1 401 bp。序列比对发现与GP2与GP2b(GI:57118006)同源性为99.91%,仅在945位碱基发生改变,与GP2a(GI:57118005)相同位置的碱基一致。GP3与GP3b(GI:57118011)同源性为94.77%,有451、700和804这3个位置的碱基发生改变,与GP3a(GI:57118009)相同位置上的碱基一样(如图1所示),说明了不同品种生姜蛋白酶基因的多样性。进一步以GP2为模板,克隆出了726 bp的GPII片段[4],并将其连接到原核表达载体pET-30a(+)构建重组表达载
体pET-GPII。
注:A中1-GPII,2-GP2,3-GP3;B为生姜蛋白酶序列比对结果。
图1 生姜蛋白酶基因序列
2.2 生姜蛋白酶的诱导表达及诱导条件优化
将重组表达载体pET-GPII转化宿主菌BL21,培养单克隆菌落至OD600=0.4,然后添加IPTG,浓度为0.05 mmol/L,发酵1 h,4 h,6 h和10 h,以未添加IPTG的pET-GPII的菌和转化空载体的菌为对照组,结果发现当诱导时间达到
6 h以后,目的基因的蛋白表达量没有显著变化(图2A)。当加入不同浓度的IPTG时,发现0.1 mmol/L的IPTG诱导表达的蛋白量最多(图2B);因此推断最佳诱导条件为37 ℃,0.1 mmol/L,IPTG诱导6 h。
 
注:A-不同诱导时间对生姜蛋白酶表达的影响;B-不同浓度的IPTG对生姜蛋白酶表达的影响。
图2 SDS-PAGE检测生姜蛋白酶的表达
3 结论与讨论
近年来随着对生姜蛋白酶的深入研究,发现生姜蛋白酶对肉类具有良好的嫩化作用,对于酒类的澄清效率远高于木瓜蛋白酶,还可作为凝乳剂来制作风味乳品。用生姜蛋白酶制备的奶酪,口感好,无苦涩感[5-6],说明生姜蛋白酶具有潜在的商业应用价值。
原核表达系统具有遗传背景清晰,细胞生长周期短,增殖速度快,发酵产量高,易于工程化等优点而受到欢迎,而且优化发酵条件可以使目的蛋白以可溶的形式生产。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因,并在原核表达系统中成功诱导表达,在37 ℃,0.1 mmol/L IPTG诱导条件下表达6 h产量最高。这为生姜蛋白酶工程化生产提供了理论基础。
参考文献
[1]冯敏,唐春红.生姜蛋白酶的研究概述[J].中国食品添加剂,2008(6):58-60.
[2]李田叶,李旻,安建乐,等.响应面法优化生姜蛋白酶提取及酸奶中的应用[J].食品工业,2015,36(7):91-95.
[3]代景泉,黄雪松.生姜蛋白酶的分离纯化[J].食品科学,2003(2):73-79.
[4]MISOOK Kim,Hamilton S E.,Guddat L W.,et al.Plant collagenase:Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger[J].2007,1770(12):1627-1635.
[5]黄冬香,李小华,李林,等.生姜蛋白酶的研究进展及其在食品加工中的应用[J].食品工业科技,2009,30(12):406-409.
[6]范金波,侯宇,黄训文,等.生姜蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究[J].食品与发酵工业,2014,40(5):65-69.
 

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