食品检验中微生物检测技术的应用

刘　轲1，张芬鹊2，贺　娜3

(1.延安市食品质量安全检验检测中心，陕西延安 716000;2.渭南市农产品质量安全检验检测中心，陕西渭南 714000;3.延安市药品检验所，陕西延安 716000)

食品安全是公众健康和社会稳定的重要组成部分，而微生物污染是导致食品相关疾病和食品召回的主要原因之一[1]。因此，准确、高效地检测食品中的微生物污染至关重要。随着科学技术的进步，食品检验中的微生物检测技术得到了广泛的应用和发展。食品中的微生物污染包括食源性病原菌、腐败菌、病毒和寄生虫等，它们可能导致食用者产生食物中毒、食源性感染和其他健康问题[2-3]。为了保障公众的食品安全，食品行业和监管机构不断探索和引入新的微生物检测技术，以便及早发现和控制潜在的食品安全风险。本论文旨在对食品检验中微生物检测技术的应用进行深入研究，关注各种微生物检测方法的原理、流程和优势，并探讨它们在食品检验中的具体应用。通过深入了解微生物检测技术的应用，为食品行业和监管机构提供有价值的指导和决策支持，以确保食品的质量和安全，保护公众的健康。

1　食品安全与微生物污染的关系

微生物污染与食品安全密切相关，食品中存在的微生物可以引发食物中毒和传染疾病。因此，对食品中的微生物进行检测和控制非常重要。食品生产和加工过程中的卫生管理、适当的加热和储存条件以及微生物检测技术的应用都是确保食品安全的关键因素。以下是威胁食品安全的几种微生物污染因素。

(1)食源性病原菌。食品中可能存在的病原菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌等，它们主要通过粪便污染食品或经不洁的加工环境进入食物中，摄入食品中的病原菌可导致胃肠道疾病，引起腹泻、呕吐、发热等症状。

(2)腐败菌和变质标志物。食品腐败常由细菌引起，如产气荚膜梭菌和腐败酵母，它们会分解食品中的营养成分，产生恶臭气味，并产生有毒代谢产物。这些细菌和代谢产物可能会导致食品变质，降低食品的质量和营养价值。

(3)致病病毒和寄生虫。除了细菌外，食品中也可能存在病毒和寄生虫，如诺如病毒、肝炎病毒和钩虫。这些病原体可以通过未经充分加热处理的食品(如生肉、生蔬菜)传播，摄入被感染的食物后，人体可能出现呕吐、腹泻、黄疸等症状。

(4)毒素产生菌。一些细菌可以在食品中产生毒素，如产生肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌。这些毒素通常无法通过加热杀灭，因此即使食物在烹饪过程中细菌被杀死，毒素仍可能存在，食用后可能导致严重的中毒症状。

2　微生物检测技术方法及流程

2.1　微生物检测技术方法

2.1.1　传统培养方法

传统培养方法是最常用的微生物检测技术之一。该技术需要将食品样品在特定培养基上进行培养，并利用细菌、真菌和酵母等微生物的生长特性对样本进行鉴定[4]。这种方法需要较长的培养时间(通常需要24～48 h或更长时间)，但具有较高的特异性和可靠性。

2.1.2　分子生物学方法

分子生物学方法利用微生物的DNA或RNA来进行检测和鉴定。其中，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是最常用的技术之一，它可以通过扩增微生物的基因片段快速检测和定量微生物[5]。实时定量PCR是一种改进的PCR技术，可以实时监测扩增反应，从而提供更精确的结果。循环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种在恒温条件下进行扩增的方法，具有较高的特异性和较快的检测速度。

2.1.3　免疫学方法

免疫学方法利用抗体与微生物的抗原结合进行检测。酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种常用的免疫学方法，可以通过测量免疫反应生成的信号来检测微生物。另外，免疫层析试纸法是一种简便快速的免疫学方法，通常用于现场快速检测。

2.1.4　快速检测技术

快速检测技术结合了多种方法，旨在更快地提供检测结果。其中，基于生物传感器的检测方法利用生物材料(如细胞、酶)与目标微生物的特定反应来产生电信号或光信号，并通过传感器检测确定目标微生物的数量。基于纳米材料的检测方法利用纳米颗粒的特殊性质，如表面增强拉曼散射(Surface Enhancement of Raman Scattering，SERS)或荧光增强效应，以此来实现微生物的快速检测。

2.2　微生物检测流程

(1)进行样品采集，从目标食品中采集代表性样品，确保采集样品时遵循卫生规范，以防止交叉污染。

(2)对采集的食品样品进行预处理，进行样品的稀释、浸泡、离心等，以去除可能存在的干扰物质，如残留农药、抑制物质等。

(3)对样品进行适当的培养处理，以增加微生物的数量，根据微生物的形态学、生理学和生物化学特征，使用适当的鉴定方法来确定微生物的种类。如果需要更精确的检测结果，可以使用分子生物学方法进行微生物检测，包括DNA或RNA提取、PCR扩增、实时定量PCR等，也可以利用抗体与微生物的抗原结合来进行免疫监测，包括酶联免疫吸附试验、免疫层析试纸法等。

(4)根据检测结果进行数据分析及解读，根据相关标准或法规确定微生物数量是否符合安全要求。

(5)生成详细的检测报告，包括样品信息、检测方法、检测结果和解读以及可能的建议措施。

3　食品检验中微生物检测技术的具体应用

3.1　实时定量PCR检测食源性病原菌

实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)检测食源性病原菌具有高度敏感性、快速性、特异性、定量能力、自动化和高通量性、可靠性和重复性等优势。它能够提供早期警示、多重检测和检测非活跃状态的微生物，适用于各种食品样品检测，这使得qPCR成为食品检验中微生物检测的重要工具，有助于确保食品安全，保护公共健康。

在实时定量PCR检测食源性病原菌的过程中，首先根据检测目的和特定要求，选择要检测的食源性病原菌。例如，选择沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7或单核细胞增生李斯特菌等。从食品样品中采集代表性样品，并进行必要的预处理，包括样品的稀释、搅拌、研磨或其他样品制备方法，以获得合适的样品溶液用于后续的DNA提取。使用商业化的DNA提取试剂盒或其他适用的提取方法，从样品中提取目标病原菌的DNA，对于RNA病原菌如诺如病毒，则需要进行逆转录反应将RNA转录成cDNA，以便进行后续的PCR分析。

准备qPCR反应体系，包括引物(特异性序列)和探针(通常带有荧光标记)，用于扩增和检测目标病原菌的特定基因片段。确保控制组包括正控样品(含有目标病原菌DNA的样品)和负控样品(不含目标病原菌DNA的样品)。在qPCR仪器中运行反应，并监测荧光信号的增加情况，该信号与扩增的目标基因片段的数量成正比，通过相对定量或绝对定量方法，最终确定样品中目标病原菌的数量。

根据标准曲线或已知浓度的参考样品，将荧光信号转化为目标病原菌的数量;根据设定的阈值，判断样品为阳性或阴性，并计算病原菌的浓度。生成详细的监测结果报告，其中包括样品信息、检测方法、检测结果、病原菌的浓度等。如果检测结果表明食品中存在食源性病原菌的污染，应通过追溯措施来确定污染源，并采取适当的控制措施，以确保食品的安全性和质量。

3.2　GC-MS技术检测食品中的腐败菌和变质标志物

气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)技术是一种联用技术，将气相色谱(GC)和质谱(MS)两种分析技术结合在一起，用于分离、鉴定和定量分析复杂混合物中的化合物。GC-MS技术在食品中腐败菌和变质标志物的检测中具有高灵敏度、高选择性、定性定量分析的优势，能够适应不同类型的食品样品检测，提供快速分析结果，为食品安全和质量控制提供了可靠的工具。

使用GC-MS技术检测食品中的腐败菌和变质标志物时，首先需要收集食品样品，如肉类、鱼类、奶制品等，并进行适当的处理(切割、研磨或溶解等)，以便提取目标化合物。使用溶剂提取、脂肪提取或固相微萃取等技术，将目标化合物从食品样品中提取出来;将提取得到的样液注入GC系统中，GC利用样品中化合物的挥发性差异将化合物分离出来。常用的气相色谱柱包括非极性柱、极性柱或选择性柱，根据目标化合物的特性进行选择。通过与GC联用的质谱仪，对分离得到的化合物进行检测和鉴定。将分离的化合物逐个引入质谱仪，分析化合物的质谱图谱，每种化合物都具有独特的质谱图谱，可与数据库中的标准谱进行比对，以鉴定化合物的类别。根据GC-MS的结果，分析和解释样品中存在的化合物，通过比对标准库中的谱图确定化合物的身份和含量。

在监测食品中的腐败菌和变质标志物时，GC-MS技术可以检测和鉴定多种挥发性有机化合物(Volatile Organic Compounds，VOCs)，如醛类、酮类、醇类、酸类和硫化合物等。这些化合物通常与食品的腐败和变质过程密切相关，通过分析这些化合物的质谱图谱可以大致确定食品样品的腐败程度和变质状态。

3.3　PCR/RT-PCR技术检测食品中的病毒和寄生虫

聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是两种常用的分子生物学技术，用于检测和扩增DNA或RNA序列。它们在食品检测中被广泛应用，具有高度敏感性、特异性和定量能力，能够快速、准确地检测和定量食品中的致病微生物或病原体。这些优势使得PCR/RT-PCR成为食品安全监测和控制中不可或缺的工具。

通过PCR/RT-PCR方法检测食品中的病毒和寄生虫时，要从食品样品中提取病毒核酸，并进行样品处理。对食品样品进行搅拌、离心和过滤等加工和处理，去除固体颗粒和杂质，并提取病毒核酸。使用商业化的RNA/DNA提取试剂盒，按照厂家提供的指南进行操作，提取食品样品中的病毒RNA或DNA，用于后续的PCR/RT-PCR分析，提取步骤通常包括细胞破碎、核酸结合、洗涤和洗脱等。如果目标病毒是RNA病毒，需要进行反转录(RT)步骤将RNA转录为相应的cDNA，使用逆转录酶(RT酶)和适当的引物进行反转录反应。使用适当的引物和PCR/RT-PCR反应体系，进行病毒核酸的扩增反应。引物的选择应基于目标病毒的特定序列，反应体系包括DNA/RNA模板、引物、酶(如聚合酶)、缓冲液和核酸扩增所需的核苷酸。

为了增加PCR/RT-PCR检测的灵敏度，应采用前处理步骤，包括预扩增或使用嵌合引物，以增加目标基因的拷贝数或缩小扩增目标的大小。扩增反应完成后通过凝胶电泳或其他检测方法分析PCR/RT-PCR产物，凝胶电泳可用于检测扩增产物的大小和质量。此外，可以使用DNA探针或比色剂等方法进行阳性结果的特异性确认。通过与已知的阳性对照样品进行比较，确认食品样品中是否存在目标病毒;使用定量PCR/RT-PCR方法来确定目标病毒的数量，从而评估食品样品中的病毒负载水平。

在PCR/RT-PCR检测中，质量控制至关重要，包括使用对照样品进行检测，以验证试剂是否无污染，同时评估检测过程中的假阳性结果。需要注意的是，不同病毒的检测方法可能会有所不同，因此在实际应用中，需要根据目标病毒的特性和检测要求进行相应的优化及调整。此外，PCR/RT-PCR方法需要特定的设备和实验条件，并且对操作者的技术要求较高，需要在实验室环境中进行。

4　结语

食品检验中微生物检测技术的应用研究对于确保食品安全至关重要。本文综述了不同微生物检测技术在食品检验中的应用，重点介绍了实时定量PCR检测食源性病原菌、GC-MS技术检测食品中的腐败菌和变质标志物以及PCR/RT-PCR技术检测食品中病毒和寄生虫的原理、流程和优势。随着技术的不断发展和改进，微生物检测技术在食品检验中的应用将更加准确、快速和便捷。未来，期待更多新技术出现，以满足食品安全监管的需求。