β-葡萄糖苷酶固体发酵培养条件的优化
王振丽,李书华,王婷婷
(河南质量工程职业学院,河南平顶山 467000)
作者简介:王振丽(1981—),女,河南平顶山人,硕士,讲师。研究方向:生物学。
摘 要:目的 研究大豆异黄酮糖苷水解酶菌株米曲霉3042的固体培养条件;方法 固态发酵,结果 确立了产酶的最适培养条件为发酵培养温度为32 ℃,发酵初始pH6.0,发酵培养84 h时酶活力最高。
关键词:大豆异黄酮糖苷;水解酶;培养条件;优化
大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物,是一类重要的生理活性物质,如防治心脑血管疾病、预防骨质疏松症、改善妇女更年期综合症等。大豆异黄酮主要有两种存在形式—游离型的苷元(Aglycon)和结合型的糖苷(Glycosides)两类,从大豆中提取的大豆异黄酮中游离的苷元占总量的2%~3%,糖苷占总量的97%~98%,而糖苷形式的大豆异黄酮不具有最佳的生理活性状态,很难被人体直接吸收,必须要经过β-葡萄糖苷酶作用,生成苷元形式才易被人体吸收[1-2]。充分发挥菌株的产酶性能还需提供最佳产酶条件[3-5],因此,β-葡萄糖苷酶的固体发酵培养条件的优化研究十分重要。
1 材料与方法
1.1 菌种与固体培养基
米曲霉3042,由辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心提供。黑豆:麸皮为2︰3、培养基中加水量与固体物料比为1.5︰1,KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.1%、(NH4)2SO4 0.5%、水杨苷0.01%,121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器
高压灭菌锅、电热恒温培养箱、7230型分光光度计、恒温水浴锅(北京)、低温高速离心机(Sigma)、超声波细胞粉碎机。
1.3 实验方法
1.3.1 产酶固体发酵
将培养42 h后的液体种子接入产酶固体发酵培养基中,接入量为10%,28 ℃恒温培养,当菌体孢子大量长出时取出,在研钵中研磨至小碎片后称取5 g加入50 mL蒸馏水,室温浸泡提取4 h,用纱布过滤,滤液于4 ℃离心后取上清液,测其β-葡萄糖苷酶的酶活力,测定时取相应的0.05 mol·L-1 pH为4.5的柠檬酸缓冲液稀释。
1.3.2 β-葡萄糖苷酶活力的测定
取3支10 mL洗净干燥的具塞刻度试管,编号后每支加1 mL的0.5%水杨苷柠檬酸缓冲液,1号管加1mL的DNS溶液作为空白对照,将3支试管同时在50 ℃水浴中预热5~10 min,加酶液0.5 mL,摇匀,置沸水浴5 min,冷却后用蒸馏水定容至10 mL,混匀,于540 nm处测A值。将每小时分解底物产生1 μmol还原糖(葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活力单位u/mL。
2 结果分析
2.1 产酶的最适温度
如图1所示,当温度达到32 ℃时,酶活力达到最高,此后随着温度升高酶活力下降,说明菌株产酶的最适培养温度为32 ℃。
2.2 产酶发酵的最适初始pH值
由图2可知,pH在4.0时菌株产酶能力很低,当pH达到6.0时产酶能力最高,当pH为7.0时酶活力开始下降,表明该菌株在发酵初始pH为5.5~7时产酶能力均相对较强,该菌的最适产酶pH为6.0。
2.3 发酵周期
由图3可知,菌株在最佳发酵条件下进行培养,随着发酵时间的延长产酶能力逐渐提高,当发酵培养到84 h时,出现产酶最高峰,酶活力达1 345.63 u·mL-1,随后随着发酵培养时间的延长产酶能力逐渐下降,其最佳发酵培养时间为84 h。
3 结论与讨论
(1)在最适固体培养基的基础上,优化米曲霉3042产β-葡萄糖苷酶的最佳培养条件,经过研究发现适宜培养条件为发酵培养温度为32 ℃,发酵初始pH6.0,发酵培养时间为84 h。
(2)大豆异黄酮苷元有利于动物的吸收利用,在一定条件下,大豆异黄酮苷元含量在β-葡萄糖苷酶作用下显著增加。因此,提高β-葡萄糖苷酶的酶活力,对利用其转化结合型大豆异黄酮的研究具有重要的意义。
参考文献
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