ELISA法检测油菜籽中的黄曲霉毒素B1
杨 权1,孙婷琳2,王 燕3,余 佳3,李利霞1,熊 英1*
(1.孝感市公共检验检测中心,湖北孝感 432000;2.湖北省粮油食品质量监督检测中心,湖北武汉 43000;
3.三峡公共检验检测中心,湖北宜昌 443000)
通信作者:熊英(1986—),女,湖北孝感人,本科,工程师。研究方向:食品中真菌毒素检测相关。E-mail:17631610@qq.com。
摘 要:为了建立油菜籽中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的快速检测方法,本文采用酶联免疫吸附法,选取不同浓度的提取液、不同种类、不同比例的稀释液检测样本的加标回收率,并进行了准确度、精密度及重复性的评价。结果发现用60%甲醇1︰5、超纯水1︰4稀释检测油菜籽样本中黄曲霉毒素B1的加标回收率为99%~106%,相对标准偏差小于5%。结果表明,酶联免疫吸附法测定油菜籽中黄曲霉毒素B1含量的准确性,重现性,稳定性好,可广泛用于油菜籽中黄曲霉毒素B1的检测。
关键词:AFB1;酶联免疫吸附法;油菜籽
黄曲霉毒素是一组真菌(霉菌)毒素,是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物[1],广泛存在于花生、大豆等农产品中,是影响花生、大豆、芝麻等农产品油料质量安全的重要因素。黄曲霉毒素具有毒性和强致癌性,毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性[2]。其中黄曲霉毒素B1是目前已知致癌性最强的天然毒素,对人及动物肝脏组织有破坏作用,人、畜摄入了黄曲霉毒素超标的食物或饲料,可发生急性中毒,出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入,可造成慢性中毒,出现肝实质细胞变性、肝硬化等,动物生长发育迟缓,体重减轻,母畜不孕或产仔少等系列症状,可诱发肝癌、胃癌等多种部位的癌症。目前黄曲霉毒素的常规检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法及酶联免疫吸附
法等[3-4]。
油菜是我国传统的油料作物,也是我国主要的油料作物。菜籽油一直是我国居民的传统生活用油,在我国植物油供给结构中,菜籽油居第二位[5]。在菜籽油实际生产中,往往会由油菜籽中引入黄曲霉毒素B1,导致成品菜籽油中可能会含有微量黄曲霉毒素B1。在检测黄曲霉毒素B1的不同方法中,酶联免疫吸附法(ELISA)由于其具有快速、灵敏、准确、操作相对简单,无需昂贵的大型仪器等优点,适用于油菜籽批量筛查检验。本文拟采用ELISA法检测油菜籽中的黄曲霉毒素B1含量,并选取合适的试验条件。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
甲醇(分析纯,国药集团);乙腈(色谱纯,国药集团);磷酸氢二钠(分析纯,国药集团);磷酸二氢钠(分析纯,国药集团);氯化钠(分析纯,国药集团);超纯水;HF4500酶标仪(美正集团生物科技有限公司);高速离心机(湘仪H1850);电子天平(梅特勒-托利多);液相色谱(岛津LC-20AT)。
油菜籽样本,孝感市孝南区种植收获采集。黄曲霉毒素B1标准品;黄曲霉毒素B1ELISA检测试剂盒(北京华安麦科生物有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 油菜籽样品前处理
采用60%、70%、80%、90%的甲醇-水作为样本提取液,提取步骤为将油菜籽样品混合均匀并粉碎(广州市旭朗机械多功能切碎机,10~80目),称取5.0 g经粉碎的油菜籽样品,加入25.0 mL上述不同浓度的提取液,在振荡器上振摇
10.0 min(转速为200 r/min),然后在4 000 r/min条件下离心5.0 min,过滤取滤液1 mL,再分别加入4 mL、5 mL、
9 mL不同体积的水和0.01 M磷酸盐缓冲液进行稀释(即1︰4、1︰5、1︰9稀释),即为样本待测液。
1.2.2 ELISA试剂盒检测样本中AFB1
将酶联免疫试剂盒从冷藏环境中取出,置于室温(20~25 ℃)平衡30 min,取出微孔板,将样本和标准品对应微孔按序编号,并记录标准孔盒样本孔所在的位置;根据产品操作流程分别加入标准品或样本50 μL到对应的微孔中,加入AFB1酶标物50 μL/孔,最后再加入AFB1试剂
50 μL/孔,用手轻敲震荡混匀,用避光膜盖住板,置室温环境中反应30 min;反应时间结束后,小心揭开膜,将微孔内液体甩干,用试剂盒中提供的洗涤液300 μL/孔,充分洗涤5次,每次间隔10 S,然后在吸水纸上拍干;加入底物显色液100 μL/孔,轻敲震荡混匀,用避光膜盖好,置室温环境反应15 min;反应时间结束,加入终止液50 μL/孔,轻轻震荡混匀,设定酶标仪波长A450/A630处测定每孔OD值。
1.3 定量分析方法
采用试剂盒专用的分析软件对结果进行分析,该试剂盒标示灵敏度为0.03 μg/kg,变异系数小于10%。最终检测结果应以实际测定的吸光度,并将对应的稀释倍数换算后计算得出。
2 结果与分析
2.1 油菜籽样本中AFB1的含量
选取5个同一批次,不同区域的样本,用高效液相色谱法GB 5009.22—2016检测其黄曲霉毒素B1含量,结果如表1所示。所测定的5个样品中,有两个油菜籽样品未检出AFB1,其他3个样品均有检出,分别为1.14 μg/kg、0.5 μg/kg、0.15 μg/kg,都未超过国家标准10 μg/kg。因此,本实验以未检出AFB1的油菜籽1为样本,以空白为基底,加标检验回收。
2.2 提取溶剂的选择
分别用60%、70%、80%、90%四种浓度的甲醇-水作为提取液对油菜籽样本进行提取(料液比=1︰5,即5.0 g样本中加入25.0 mL提取液),1︰4水稀释,得到AFB1加标回收率的结果如表1所示(每个加标平行测定3次)。由表1可知,60%甲醇-水提取液对样本的提取效果较为理想,回收率为103.2%。考虑高含量有机试剂对环境及操作人员危害性,及高浓度的甲醇可能会对抗原和抗体的结合产生抑制作用,造成结果的不准确。综合选取60%浓度的甲醇-水提取液为最佳提取溶剂。
2.3 稀释方法的选择
查阅文献可知,提取比例在1︰5时有足够的提取效率,且可得到足够的上清液。固提取比例固定在1︰5,选取不同的稀释比例及稀释液进行优化。由于检出限不能过高,选体积比为1︰4、1︰5、1︰9的不同稀释比例,稀释液分别采用超纯水和0.01 M PBS。结果如表2所示,当提取比例为1︰5,水为稀释液时,稀释比例为1︰4、1︰5、1︰9的3种条件下的回收率分别为104%、110%、96%,都在可接受范围内,且检出限满足要求。当稀释比例为1︰4、1︰5、1︰9,稀释倍数分别是25倍、30倍、50倍,综合考虑检出限及回收率,1︰4的稀释比例更为合适,该方法的倍数为25倍。当0.01 MPBS作为稀释液时,无论何种稀释比例,回收均偏高,且出现假阳性的现象,因此确定该稀释液不适用。
2.4 实际样本的检测
将样本按曲线点添加0 μg/kg、0.75 μg/kg、3 μg/kg、
12 μg/kg、50 μg/kg AFB1标准溶液,按照上述60%甲醇1︰5
提取,超纯水1︰4稀释,测定样本中AFB1含量,计算回收率,每个浓度测定3次平行。结果如表4所示,回收率在91%~106%,平均回收率为100%。说明60%甲醇1︰5提取,超纯水1︰4稀释测定样本中AFB1含量的准确率高,稳定性较好,完全满足日常监测的需求。
3 展望
传统的酶联免疫方法,利用抗原和抗体结合的原理实现了多种样本的检测,随着人们研究的深入在逐渐扩大,一些特殊样本的检测灵敏度甚至超过了仪器方法。当然在生活水平日益提高的同时,人们对
食品安全的关注也越来越高,对不同样本的检测方法提出了更高的要求,例如更便捷、更灵敏、更快速等。目前一些技术在市场上已经有所体现,例如微阵列芯片、电化学传感器、化学发光、微流控、免疫荧光等各种技术都在
食品安全检测行业有应用。本文开发的油菜籽方法,在技术上达到其中黄曲霉毒素B1检验的要求,具有高准确度、高精密度、安全性好、快速的特点。为该类样本的检测提供了一个前期基础,希望在未来能够实现更高效、高灵敏的检测。
参考文献
[1]李江,李晓明,綦艳,等.酶联免疫法检测酱油中的黄曲霉毒素B1[J].食品安全质量检测学报,2016(12):5.
[2]李培武,马良,杨金娥,等.粮油产品黄曲黄曲霉毒素B1检测技术研究进展[J].中国油料作物学报,2014,36(3):404-408.
[3]李少晖,任丹丹,谢云峰,等.食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报,2015(4):1107-1115.
[4]蔡正森,钟文辉,张东升,等.ELISA法和HPLC法检测粮油食品中黄曲霉毒素B1含量的比较研究[J].中国卫生检验杂志,2004,14(3):302-304.
[5]陈静.湖北省油菜产业发展问题研究[D].武汉:华中农业大学,2014.