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芹菜素对人脑胶质瘤细胞凋亡作用的研究

2021-03-24 10:45:32 来源: 食品安全导刊

  芹菜素对人脑胶质瘤细胞凋亡作用的研究
  
  本文主要研究芹菜素对人脑胶质瘤细胞U87凋亡的影响及机制。方法:应用CCK8法检测细胞增殖抑制率。流式细胞术检测细胞周期。Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达。结果:①芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖。②不同浓度的芹菜素作用24h,G2期细胞所占比例呈下降趋势。③芹菜素处理组的细胞,Bcl-2蛋白的表达量随着芹菜素浓度的增加而降低,Bax蛋白的表达量则随芹菜素浓度的增加而升高。结论:芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖,并可能通过线粒体信号途径诱导其凋亡。
  
  胶质瘤(glioma)是最常见的恶性程度极高的中枢神经系统肿瘤,占颅内恶性肿瘤的78%左右[1]。胶质瘤起源于神经系统胶质细胞和神经元细胞,是一类高度血管化的肿瘤,具有弥漫性浸润性生长、侵袭性强、易复发、难切除、预后差[2,3]等特点, 其中位生存期只有一年左右[4-6]。在全身性恶性肿瘤中,恶性胶质瘤5年病死率紧随胰腺癌和肺癌之后,位居第3位[7,8]。
  
  芹菜素是一种天然的黄酮类化合物[9],低毒,无诱变性[10],抗癌谱广,是抗肿瘤药研究的热点之一,但其对胶质瘤的确切作用及机制尚缺乏系统研究。本研究采用芹菜素对人脑胶质瘤细胞系U87进行体外干预,以研究芹菜素对胶质瘤细胞凋亡的影响及机制。
  
  材料与方法
  
  实验细胞系
  
  选择人脑胶质瘤细胞系U87作为研究对象,购于北纳生物有限公司。
  
  主要试剂
  
  芹菜素和RIPA细胞裂解液购于北京索莱宝科技有限公司;DMEM完全培养液(1×)和CCK8法细胞增殖检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司;兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗体、GAPDH均为美国CST公司产品;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG为上海碧云天生物技术有限公司产品;PVDF膜为Millipore公司产品。
  
  方法
  
  芹菜素工作液的制备  原芹菜素浓度是10mmol/mL,需配制成20umol/L、40umol/L和80umol/L。将原芹菜素稀释1000倍即得到浓度为10umol/mL的芹菜素浓度。依次将2uL、4uL和8uL芹菜素溶解在1mL相应培养基中即可得到所需的实验浓度。
  
  细胞培养  将人脑胶质瘤细胞U87置于含有10%胎牛血清、0.2%NaHCO3、0.3%HEPES 的DMEM培养基中,置于37℃、5%CO2 的恒湿孵箱中进行培养。每天观察细胞生长情况,由于各细胞生长周期不同,每2天换次培养液,3~5天用0.25%的胰酶消化传代一次,取对数生长期细胞(即培养瓶底布满80%时)进行实验。
  
  实验分组  实验共分5组:芹菜素低浓度组(20 umol/L)、芹菜素中浓度组(40 umol/L)、芹菜素高浓度组(80 umol/L)、空白对照组(只加培养基)和阴性对照组(DMSO+培养基)。处理24h后收集所需细胞进行检测。
  
  CCK8法检测芹菜素对U87细胞增殖的影响
  
  对细胞铺板于96孔板贴壁后细胞换液,每孔100ul;每孔加入10ul CCK8试剂,按 20umol/L、40umol/L、80 umol/L浓度梯度设定的芹菜素工作液,分别处理实验组细胞,置于培养箱中孵育2h;酶标仪在450nm波长下,测吸光度(OD)值。同等条件下重复实验三次,计算肿瘤细胞的存活率。肿瘤细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
  
  流式细胞术检测细胞周期  
  
  用20umol/L、40umol/L、80 umol/L浓度芹菜素工作液处理U87细胞,培养24h,胰酶消化,PBS洗涤2次,离心,70%乙醇4℃固定过夜,PBS洗涤2次,离心,碘化丙啶染色,室温避光孵育30分钟。500ul PBS重悬细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化。
  
  Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达  
  
  用20umol/L、40umol/L、80 umol/L浓度芹菜素工作液处理U87细胞,24h后,收集细胞,3000r/min离心10min后,冰PBS冲洗,加入细胞裂解液,冰上裂解30min后,4℃,10000r/min离心10 min,小心吸取上清,获得总蛋白并测定蛋白浓度。蛋白变性,上样,经十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳1~2h,后湿法转膜30~50min。加入GAPDH一抗(1:1000)、Bcl-2一抗(1:1000)、Bax一抗(1:1000)孵育,4℃过夜;加入山羊抗兔二抗(1:2000)室温孵育1~2h。在膜上滴加电化学发光(ECL)显色液,在凝胶成像系统下成像并测定条带灰度值。
  
  统计学方法  
  
  采用SPSS 19.0统计软件包处理数据。计量数据用均数±标准差(mean±SD)表示。各项参数值之间的比较分别采用t检验和χ2检验,以P <0.05为差异有统计学意义。
  
  结果
  
  芹菜素对胶质瘤细胞U87增殖的影响
  
  CCK8法检测结果显示芹菜素对胶质瘤细胞U87具有增殖抑制作用。与对照组比较,不同浓度的芹菜素工作液处理24h后,细胞生存率下降,细胞生长明显受抑制;并且随着芹菜素浓度的增高,抑制细胞增殖的效果越明显(图1)。
  
  流式细胞术检测细胞周期结果  
  
  分别用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液处理U87细胞24h后,细胞周期各时相所占的比例不相同。随芹菜素浓度的增加,G2期细胞所占比例呈下降趋势。但20umol/L和40umol/L的芹菜素抑制细胞增殖的作用不明显;芹菜素工作浓度增加至80umol/L时,则能明显抑制细胞的增殖(图2)。
  
  凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达 
  
  分别用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液处理U87细胞24h后,检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。随芹菜素浓度的增加,Bcl-2蛋白的表达量呈下降趋势,Bax蛋白的表达量呈上升趋势(图3)。
  
  讨论
  
  近年来,天然植物提取物单体以其对正常细胞毒性小,对恶性肿瘤细胞毒性大和促凋亡而备受青睐。
  
  芹菜素,又称芹黄素,是一种天然的黄酮类化合物,广泛存在于自然界中,以植物黄色素的形式在茶叶、蔬菜、水果、豆类和香料中广泛分布,中药如地钱、西藏雪莲花、车前子、络石藤等中也有很高的含量,其中以芹菜根的含量最为丰富,目前已经可以人工合成。通过大量研究发现芹菜素具有抗肿瘤、抗突变、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗焦虑、保护心血管、保护中枢神经等多种生物活性,其中其抗肿瘤作用最为突出,并且与其他黄酮类物质( 如槲皮素、山奈黄酮等) 相比,具有低毒性及无诱变性等优点[10]。
  
  芹菜素抗肿瘤作用[11-12]的主要机制有:(1)调控细胞周期运行,抑制肿瘤细胞增殖;(2)诱导肿瘤细胞凋亡;(3)干扰肿瘤细胞信号传导;(4)抑制肿瘤血管生成、侵袭和转移。孙悦等[13-14]的研究表明,芹菜素可诱导胃癌细胞凋亡,并且诱导胃癌细胞凋亡的作用呈现药物浓度依赖性,同时证明芹菜素诱导胃癌细胞凋亡的机制主要是通过Bcl-2/Bax-Caspase-3、Caspase-9的线粒体凋亡通路活化实现的。SHUKLA等[15]研究发现,芹菜素可通过诱导前列腺癌细胞周期阻滞于G2/M期,从而有效抑制前列腺癌细胞的增殖,抑制作用表现出现药物浓度依赖性。
  
  本研究中,CKK8法检测结果显示,芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖;并且随着芹菜素浓度的增加,对瘤细胞增殖抑制的作用也越明显,与贡伟一等[16]的研究结果一致。流式细胞术检测细胞周期的结果显示,高浓度的芹菜素可明显减少胶质瘤细胞G2期的细胞数目,提示芹菜素可调控细胞周期的运行,从而抑制肿瘤细胞的增殖能力。在随后进行的凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达的研究中,我们的结果显示芹菜素能够上调Bax蛋白的表达,而Bcl-2蛋白的表达则降低;并且随着芹菜素浓度的增加,Bax蛋白的表达量呈上升趋势,Bcl-2蛋白的表达量则呈下降趋势,提示芹菜素可通过调控凋亡基因、调节参与凋亡的蛋白的表达等方式诱导肿瘤细胞凋亡。此外,不同浓度的芹菜素处理胶质瘤细胞24h后,Bcl-2/Bax比值逐渐降低,我们推测芹菜素可能是通过降低Bcl-2/Bax比值,诱导线粒体依赖的凋亡途径,从而实现其诱导胶质瘤细胞的目的。
  
  综上所述,本研究通过研究芹菜素对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响,探讨芹菜素抗胶质瘤作用的可能机制,以期为中西医结合治疗胶质瘤提供新的思路和方法。
  
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  作者简介:曲晓媛 硕士,副教授。研究方向:肿瘤病理学。
  
  基金项目:山东省中医药科技发展计划项目“芹菜素对人脑胶质瘤细胞U87、U251体外抗肿瘤作用的实验研究”(编号:2015-200)。
  
  曲晓媛1  卢强 1 贾世磊  2
  
  1.山东中医药高等专科学校免病教研室  
  
  2.山东省烟台护士学校临床教学部

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