LC-MS/MS法同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的应用研究

　　

　　β-受体激动剂，俗称瘦肉精，不是某一种特定的药物，而是一类药物，能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长。当它们以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”，促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。[1-3]

　　

　　但瘦肉精用量大、作用的时间长、代谢慢，所以在屠宰前到上市，在动物体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体，就使人体渐渐地中毒，如果一次摄入量过大，就会出现异常的生理反应，因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉类后会出现头晕、恶心、手脚颤抖、心跳加速甚至心脏骤停致昏迷死亡，特别对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病和甲状腺机能亢进等患者有极大危害。[4-7]

　　

　　在中国，通常所说的“瘦肉精”则是指盐酸克伦特罗。它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。其它类似药物还有沙丁胺醇和特布他林等，都因为对人体健康危害过大，造成安全隐患，而在全球遭到禁用。在2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物使用β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）[8-12]。

　　

　　因为能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长，瘦肉精让猪、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高，带来更多经济价值，国内养殖户不顾农业部的规定，在饲料中掺入过量瘦肉精，给市场上的肉类食品带来了严重的安全隐患，所以研究出科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。

　　

　　目前常用的β-受体激动剂检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法（GC/MS）、酶联免疫法（ELISA）和液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）。其中HPLC法灵敏度较低，不能满足痕量检测要求[13-15]；GC/MS法除了需要大量的前处理步骤，还要求进行衍生化操作，较为繁琐；ELISA法虽然操作简单，但极容易出现假阳性情况，定性结果的准确性较差；只有LC/MS/MS法具有高效的分离能力和准确的定性定量能力，被广泛使用，但此法也因为复杂耗时的前处理而被诟病[16]。因此建立一种科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。

　　

　　材料与方法

　　

　　仪器与试剂

　　

　　仪器名称：NexeraX2超高效液相色谱和8045电喷雾三重四级杆质谱仪（日本岛津）、ULPHW-I超纯水机（上海优普）、MTN-2800W氮吹浓缩仪（德国AUTO Science公司）、超声波清洗机（昆山洁力美）、H1850R冷冻离心机（湘仪仪器）、TG16-WS高速离心机（湘仪仪器）、VM-D涡旋混合器（上海皓庄仪器）、JY2002百分之一电子天平（舜守恒平仪器）、肉类绞碎机（嘉厨食品机械）、ATX224万分之一电子天平（日本岛津）；仪器经校准检定合格后方可使用。

　　

　　标准溶液名称：实验所用β-受体激动剂类标准品：盐酸克伦特罗（Clenbuterol）、莱克多巴胺 ( Racto pamine）、沙丁胺醇（Salbutamol）、特布他林（Terbutaline）、西马特罗(Cimaterol)、氯丙那林（Clorprenaline）、溴布特罗(Brombuterol)、齐帕特罗 (Zilpaterol)、喷布特罗（Penbutolol)、马布特罗（Mabuterol)、妥布特罗（Tulobuterol)、非诺特罗（Fenoterol）采购于曼哈格公司。

　　

　　同位素内标克伦特罗-D9 (Clenbuterol-D9）、莱克多巴胺-D3 (Ractopamine-D3）、沙丁胺醇-D3(Salbutero1-D3），购于Dr .Ehrenstorfer公司。

　　

　　实验试剂与耗材：乙腈（上海安谱公司，色谱纯）、甲醇（上海安谱，色谱纯）、乙酸（山东西亚，色谱纯）、甲酸（山东西亚，色谱纯）、无水硫酸镁（国药集团，分析纯）、无水硫酸钠（国药集团，分析纯）、乙酸铵（国药集团，分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（国药集团，分析纯）、C18填料(天津博纳艾杰尔), 粒径40-60μm、PSA填料(天津博纳艾杰尔), 粒径40-60μm、GCB填料(天津博纳艾杰尔)，粒径40-60μm；

　　

　　方法

　　

　　实验色谱和质谱条件

　　

　　色谱条件为：色谱柱： C18色谱柱， 规格2.1×100mm，粒径1.9μm；柱温：32℃；进样体积：2μL；流速：0.3mL/min；流动相A是体积浓度为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液[17]，洗脱梯度，洗脱条件见表1；所述初始流动相是体积比为9:1的0.1%甲酸水溶液和乙腈的混合液；

　　

　　质谱条件为：雾化气流速：3.0L/min；干燥气流速：10.0L/min；加热气流速：10.0L/min；DL管温度250℃[18]；加热气温度：350℃；接口电压：4000V；离子源类型：电喷正离子模式；扫描方式：多反应监测扫描；氦气作为碰撞气，雾化气和加热气均为氮气，干燥气为洁净空气，各个物质及内标物的主要质谱参数见表2:

　　

　　标准溶液的制备

　　

　　混合标准工作溶液：分别称取10mg的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、西马特罗、氯丙那林、溴布特罗、齐帕特罗、喷布特罗、马布特罗、妥布特罗、非诺特罗12种β-受体激动剂，用甲醇溶解并定容至100mL,此贮备液浓度为100mg/L，得到混合标准贮备液，用0.1%甲酸水-乙腈（9:1）来稀释混合标准贮备液，配制混合标准工作溶液，浓度梯度为0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，且每个浓度梯度中均加入有6ng的同位素内标物, 同位素内标物由质量比为1:1:1的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3组成。

　　

　　混合内标标准工作溶液：分别称取10mg的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3三种β-受体激动剂内标物质,用甲醇溶解并定容至100mL,此贮备液浓度为100mg/L，得到混合内标标准贮备液，用0.1%甲酸水溶液稀释混合内标标准贮备液，配制混合内标标准工作溶液，使其浓度都相当于50ng/mL。

　　

　　混合标准贮备液和混合内标标准贮备液需保存在-20℃冰箱中冷冻，有效期一年；混合标准工作溶液和混合内标标准工作溶液需保存在4℃冰箱中冷藏，有效期一周。

　　

　　混合提取剂的制备

　　

　　混合提取剂是体积比为2:1:9的0.25mol/L乙酸铵水溶液、0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠水溶液和1.5%甲酸乙腈溶液的混合液；所述0.25mol/L乙酸铵水溶液用乙酸调节pH值为5.2[19]。

　　

　　混合除水试剂的制备

　　

　　混合除水试剂由质量比为3:1的无水硫酸镁和无水硫酸钠组成。

　　

　　混合净化试剂的制备

　　

　　混合净化试剂由500mg无水硫酸镁，75mg N-丙基乙二胺,100mg十八烷基键合硅胶,25mg石墨化碳黑组成[20]。

　　

　　样品溶液的制备

　　

　　购买牛肉实验样品8份（每份不少于500g），对市面上购买的实验样品（不少于500g）进行绞碎处理，并充分混匀样品，称取5.0g绞碎后的牛肉样品，向猪肉样品加入120μL混合内标标准工作溶液和12mL混合提取剂，旋涡混匀1min，超声处理20min后，加入4.0g混合除水试剂，混匀，10000rpm离心3min，得到提取液；量取3mL提取液于离心管，加入混合净化试剂，漩涡震荡30s，5000rpm离心1min后，40℃水浴氮气吹至近干后，用1mL初始流动相定容，经0.22μm滤膜过滤，得到样品溶液。

　　

　　上机检测

　　

　　用液相色谱串联质谱仪检测样品溶液和混合标准工作溶液，并以β-受体激动剂的质量浓度为横坐标，以β-受体激动剂的峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算牛肉中β-受体激动剂的含量。

　　

　　结果分析

　　

　　标准溶液曲线图

　　

　　12种混合合标准工作溶液的图谱见图1；

　　

　　1沙丁胺醇、2特布他林、3西马特罗、4莱克多巴胺、5盐酸克伦特罗、6氯丙那林、7溴布特罗、8齐帕特罗、9喷布特罗、10马布特罗、11妥布特罗、12非诺特罗

　　

　　控制各个化合物质量浓度梯度为0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，以各个标准工作溶液的质量浓度X为横坐标，以其标准品的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线。同时要控制待测样品的质量浓度在标准工作曲线的范围内。分析实验数据后得到12种化合物的线性方程，相关系数，保留时间，和检测低限见表3：

　　

　　8份牛肉实验样品检测结果见表4：

　　

　　经实验分析，在不同市场上购买的新鲜牛肉均未检出此方法中讲述的12种β-受体激动剂。

　　

　　选取空白基质样品，使用上述前处理方法，仪器分析方法以及耗材和仪器对其进行了添加回收实验，添加量分别为0.5ng/mL，2.5ng/mL，7.5ng/mL，色谱图峰型良好，保留时间较稳定，能够满足检测需求，实验结果见下表5：

　　

　　表5可以看出，本方法的添加回收率为85.37%-97.78%，RSD≤11.6%，表明本方法可以保证检测结果的准确度和可重复性，可达到检测要求，满足猪肉中β-受体激动剂的检测。

　　

　　结果与讨论

　　

　　本实验建立一种同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的LC-MS/MS法。本方法中12种β-受体激动剂在质量浓度为0.1ng/mL~10.0ng/mL范围内线性关系良好（R2≥99.85），添加回收率为85.37%-97.78%，RSD≤11.6%。本方法检测准确度高、定性准确快捷、无需对样品衍生化处理、前处理时间短、减少基质干扰、检测时间短、同时减少有毒试剂的使用，值得推广使用。

　　

　　参考文献：

　　

　　[1]王永红,丁平,朱英才,等.液质联用高灵敏检测动物尿液中10种β受体激动剂方法研究[J]，南方农业，2011:22-24；

　　

　　[2]滕南雁,刘向红,何颂华,等.氘代同位素内标液相色谱—串联质谱法测定猪肉、猪肝中8种β受体激动剂类药物残留[J]，中国卫生检验杂志，2011:1617-1620；

　　

　　[3]申惠敏,杜娟,贾秀珍,等.动物性食品中一受体激动剂类残留检测方法研究进展[J],山东畜牧兽医，2014:80-81；

　　

　　[4]邓咏,梅刘萍.液质法测定猪肉中3 种β受体激动剂残留量[J],肉类工业,2014:49-51；

　　

　　[5]郭睿,曹院章,齐海霞,等.动物源性食品中β受体激动剂残留检测方法的改良[J],中国畜牧兽医文摘,2015:50-51；

　　

　　[6]张林田,林文,陆奕娜,等.超高效液相色谱－串联质谱法检测动物源性食品4种β-受体激动剂[J],检验检疫学刊,2013:44-49；

　　

　　[7]万宇平,凌莉,高东微,等.β-激动剂类兽药残留检测技术研究进展[J],饲料工业,2013:56-58；

　　

　　[8]刘谦,颜红.氘代同位素内标液相色谱串联质谱测定肠衣肉类肝脏中5种β受体激动剂类药物残留[J],中国兽医杂志,2013:80-83；

　　

　　[9]李飞.液相色谱-串联质谱在食品安全检测方面的应用[D],河北师范大学,2009；

　　

　　[10]刘新辉,马小岭,季秋红,等.超高效液相色谱－串联质谱法检测动物源性食品中的β－受体激动剂类和喹诺酮类物质[J],邵阳学院学报(自然科学版),2020:55-66；

　　

　　[11]高照,张援,张亦农,等.动物组织内残留β-受体激动剂的检测方法研究进展[J],中国运动医学杂志,2014:370-378；

　　

　　[12]代立勤,崔银仓.超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中5 种β-受体激动剂残留[J],现代农业科技,2018::253-257；

　　

　　[13]倪炜华.UPLC-MS/MS 测定动物源食品中9 种β-受体激动剂[J],化学分析计量,2017:67-71；

　　

　　[14]拜锦美.液相色谱-质谱联用仪在畜禽产品质量安全检测中的应用[J],化学分析计量,2015:101-104；

　　

　　[15]曲斌,耿士伟,陆桂萍,等.新型 QuEChERS 方法结合液相色谱串联质谱法快速测定猪肝中β-受体激动剂残留[J],食品安全质量检测学报,2015:4747-4754；

　　

　　[16]李广兴,韩溪,吴岩,等.猪肉β-受体激动剂UPLC-MS/MS 检测方法建立与应用[J],东北农业大学学报,2015:45-51；

　　

　　[17]方萍,林慧,颜春荣,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中20 种β-受体激动剂[J],食品安全质量检测学报,2016:1645-1651；

　　

　　[18]王权帅,孙卫明,刘建荣,等.猪肉中特布他林等4 种瘦肉精残留量的固相萃取-气相色谱质谱联用测定法[J],职业与健康,2015:181-183；

　　

　　[19]刘敬先,苗翠,刘笑,等.超高效液相串联质谱法分析牛肉中残留的β-受体激动剂[J],药物分析杂志,2014:1836-1841；

　　

　　[20]曾绍东,王明月,杨春亮,等.超高效液相色谱－质谱法测定猪肉中9种β-受体激动剂残留量[J],分析仪器,2013:5-11;

　　

　　项目基金：基金项目：安徽省科技重大专项(农业领域)基金项目(18030701203)。

　　

　　作者简介：张洋，男，工程师，研究方向为食品检测。

　　

　　张洋

　　

　　安徽国科检测科技有限公司，安徽合肥，230001