简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法

　　

　　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也称为绿脓杆菌，属于假单胞菌属。广泛分布于自然界（土壤、空气、水源等）及正常人皮肤、肠道和呼吸道，大小为（1.5~3.0）μm×（0.5~0.8）μm，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。该菌在普通培养基上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多数直径在 2~3 mm，边缘不整齐，扁平湿润。在血琼脂平板上形成透明溶血环。铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。

　　

　　目前检测铜绿假单胞菌的标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。近几年，随着科技的发展，检测铜绿假单胞菌的方法多种多样，本文对近年铜绿假单胞菌检测技术进行综述，为铜绿假单胞菌的快速、准确检测研究技术提供参考。

　　

　　

　　

　　检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》。铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素；铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长；具有氧化酶，可以使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物；根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。

　　

　　

　　外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据 GenBank 中铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，并利用实时荧光 PCR技术，对目标靶序列进行特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。

　　

　　环介导等温扩增技术（以下简称LAMP）：利用链置换DNA聚合酶在等温条件下进行反应，40min内可完成核酸扩增，检测过程不需要昂贵的仪器设备，简单的水浴锅即可，扩增产物不需要繁琐的电泳过程，快速灵敏，特异性强，成本低，尤其适合大量、即时、现场的病原微生物的初筛，易于在基层推广应用。

　　

　　

　　酶底物法（Pseudalert）采用特异性固定底物技术，目标细菌产生能够分解 Pseudalert 底物特定的酶，产生荧光，在24 h内即可得到结果，无需进行验证试验，该方法能够较好地弥补传统滤膜法在检测工作中的不足，在美国和欧洲部分地区已经被批准为检验铜绿假单胞菌的标准方法。

　　

　　

　　近年来瓶、桶装水监测发现各种污染物如铜绿假单胞菌等污染问题逐渐增多，因瓶、桶装水中污染物如铜绿假单胞菌污染引起的食物中毒也时有发生，成为公共卫生的重大隐患。国标方法作为一种传统、经典的检测方法，与实时荧光定量PCR方法、LAMP方法、酶底物法一起成为食品安全检测的重要工具。传统方法假阳性率低，但检测周期长。随着技术研究的不断深入，希望核酸方法、酶底物法能够进一步优化和完善，实现快速、特异、灵敏、高通量，可广泛应用于食品安全检测、检验检疫、卫生防疫、疾病诊断等领域，前景非常广阔。

　　

　　马慧娟  徐慧  高宏

　　

　　江苏省理化测试中心