普通PCR与实时荧光PCR两种方法研究鸭血中的鸭源性成分

□ 范美霞 黄立强 徐传霞 贾楠楠 菏泽市食品药品检验检测研究院

摘　要：本研究采用普通PCR与实时荧光PCR两种方法对山东省菏泽市市售鸭血中的鸭源性成分进行检测，发现两种方法在检验结果上存在一致性。

关键词：普通PCR 实时荧光PCR 鸭血 鸭源性

鸭血富含蛋白质和多种微量元素，这两种特性使其具有补血与清热解毒的作用，而且对预防和治疗缺铁性贫血症具有较好的效果。虽然鸭血食用性较强，但在庞大的动物体系中，鸭子的血液量并不高，致使鸭血价格相对较高。正因如此，部分不法商家会在鸭血中掺杂猪血或其他动物血液来销售以牟取利益。近年来，随着对于动物源性基因组的研究逐渐增加[1]，以DNA为基础的PCR技术在该领域日益盛行[2]。就动物血液而言，由于其保质期短，故在加工制作的过程中会添加食用盐和凝固剂[3]等化学物质，加之在提取鸭血DNA过程中的物理作用等会对DNA造成破坏，最终导致DNA含量有所降解而使检测结果存在偏差。目前，检测鸭源性成分的方法主要有《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分：鸭成分检测PCR法》(SN/T 3731.5-2013)[4]和《饲料中禽源性成分检测方法 实时荧光PCR法》(SN/T 2727-2010)[5]，前者是普通PCR法，后者为实时荧光PCR法。相较而言，普通PCR灵敏度较低，实时荧光PCR灵敏度较高，但是对于一些特殊样品需要将二者结合使用。本研究旨在通过两种实验方法的有机结合，以期为鸭血中鸭源性成分检验提供一定的实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

1.1.1 材料

鸭血，市售。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司;DNA提取试剂盒，天根生物公司;鸭源性检测试剂盒，Takara公司。

1.2 主要仪器

Rotor Gene Q 荧光定量PCR仪，凯杰;普通PCR仪器。

1.3 样品总DNA提取

鸭血的提取方法按照DNA提取试剂盒的相关说明进行。

1.4 普通PCR反应

按照SN/T 3731.5-2013[4]进行。

1.5 实时荧光PCR反应

1.5.1 反应体系

预混液12.5μL、上下游引物各1μL、探针1μL、模板DNA 1μL，加超纯水至25μL。

1.5.2 反应条件

预变性95℃(10s)，变性95℃(5s)，退火延伸60℃，40个循环，根据扩增曲线Ct值≤35为检出鸭源性成分。

2 结果与分析

将所提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行PCR扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。同时，对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行实时荧光PCR检测，实验结果见图2。

由图1可知，阴性对照和空白对照均无条带产生，阳性对照在226bp处有条带产生。该图谱说明所提取的鸭血DNA在226bp处有可见条带，检出鸭源性成分。为确定鸭源性成分，故将所得的扩增产物进行核酸测序，并与SN/T 3731.5附录A中鸭线粒体细胞色素C氧化酶Ⅲ基因相对应片段的序列对比，其片段大小正确，同源性达到98%，确证含有鸭源性成分。由图2可知，实时荧光PCR检测结果中，阴性对照和空白对照均未检出，阳性对照正常，Ct值为19.53，两个平行样品Ct值分别为22.97与22.31，表明检出鸭源性成分。同时表明，两种检验方法具有一致性。

3 讨论

本研究通过采用普通PCR与实时荧光PCR两种方法对鸭血中的DNA样品进行检测，结果表明，两种方法的结果存在一致性。由此可见，两种方法可以相互补充——普通PCR灵敏度低，可能对检测结果造成误判，故需要灵敏度高的实时荧光PCR法进一步确认结果的可靠性。另外，对于鸭血样品来说，由于特殊的制作工艺会使其在制作过程中受到一些特殊因素的影响而造成核酸降解，影响检测结果，进而出现假阴性[6]。如徐慧等[7]在用普通PCR研究鸭血中鸭源性成分时，初次实验，两种方法均未检出鸭源性成分，通过增加模板量，进行二次扩增才进一步确定了该成分的存在。作为检测机构，必须将两种方法结合起来对鸭血样品进行合理性、完善性检验，方可获得可靠的数据，进而出具一份确凿的实验报告。

参考文献：

[1] 高丹丹，陈燕，王迎华等.动物肉制品基因组DNA的提取和纯化[J].食品科技，2007(8):42-44.

[2] 全国文献工作标准化技术委员会.《进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法-PCR方法》(SN/T 1119-2002)[S].北京：中国标准出版社，2002.

[3] 邵碧英，杨婕，张体银.动物产品的DNA提取方法[J].畜牧与兽医，2005，37(9)：47-49.

[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分：鸭成分检测-PCR法》(SN/T 3731.5-2013)[S].北京：中国标准出版社，2013.

[5] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.《饲料中禽源性的鉴定方法实时荧光PCR法》(SN/T 2727-2010)[S].北京：中国标准出版社，2011.

[6] 吕二盼，周正等.动物源性食品鸭血、猪血DNA提取及多重PCR研究[J].食品工业科技:201233(6):228-231.

[7] 徐慧，马慧娟，动物源性食品鸭血中鸭成分普通PCR检测方法研究[J].《食品安全导刊》2018.3:60-61.