智能厌氧培养系统在食用益生菌领域的应用展望

□ 赵德锟 杭州大微生物技术有限公司

本文介绍了一种创新的智能厌氧培养系统——以数字化精确控制厌氧培养气体环境的生成，并且具备对多种创新的培养环境进行平行研究(同时生成：多种气体、多种浓度、多种温度可选)的能力。此外，还展望了该系统在食用益生菌相关研究领域包括益生菌制品活菌计数、耐氧益生菌菌株驯化、益生菌生产工艺质控、微生物培养组学(culturomics)、中药类保健食品成分的肠内生物转化、肠道微生物体外模型这6大细分领域的应用前景。

DW-100A-K智能厌氧微生物培养系统是业内率先实现数字化精确控制厌氧培养气体环境(0~15%氧气浓度可调)生成，并且可实现多个独立培养罐体中同时进行多种培养环境(多种气体、多种浓度、多种温度可选)平行研究的厌氧菌培养研究平台。目前，该系统广泛应用于临床致病厌氧菌检测、益生菌和肠道菌群(多数为厌氧菌)研究，以及食品安全厌氧污染菌检测等领域。在此，笔者展望了智能厌氧培养系统在益生菌相关研究中的应用前景。

1 酸乳等益生菌制品中的活菌计数

益生菌酸奶是目前市面上较为常见的活性益生菌制品之一，它是在常规发酵乳的基础上添加了一种或几种乳酸菌类(如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌)的酸乳，具有平衡和改善胃肠道功能、增强人体自身免疫能力等特点。然而，此类酸乳的特殊营养作用和保健功能取决于其成品中是否含有足够数量级的活性益生菌，因此统计各种益生菌制品的活菌总数成为判断益生菌酸奶品质好坏和功能活性高低的重要手段。

GB 6321-2003《乳酸菌饮料卫生标准》和GB 9302-2010《发酵乳》中均对产品中乳酸菌数量有所要求，即≥1×106cfu/mL。目前，我国关于活性益生菌产品中的活菌计数主要参考GB 4789系列食品安全国家标准食品微生物检验方法中有关乳酸菌和双歧杆菌的标准执行。在此方法中，稳定可靠的厌氧培养环境是保证活菌计数结果准确的基础，也是产品品质保障的关键。

DW-100A-K智能厌氧培养系统的工作原理是通过内置精密无油真空泵、毫巴级压力传感器和软件控制系统来自动控制气体的抽排与置换，从而保证所连接的培养罐内数分钟即达到厌氧、微需氧或特定氧浓度设定的气体培养环境。然后，将设定好的气体环境培养罐与主机分离，再置于任意温度的恒温培养箱中进行培养。智能厌氧培养系统在益生菌制品的活菌计数实验过程中提供了稳定、专业的厌氧培养条件，提高了计数结果的准确性和稳定性，为益生菌制品企业的品控提供了技术支撑。同时，该系统也可应用于市场监管部门的监督检验活动中。

2 耐氧优良益生菌菌株的驯化选育

益生菌种类繁多，其中双歧杆菌无疑是最具发展潜力的一类益生菌。双歧杆菌可用于调节人体的肠道微生物，且具有治疗腹泻、缓解乳糖不耐症和降低血清、胆固醇等作用。然而，由于双歧杆菌为严格厌氧菌，且缺少有效的活性氧清除机制，故一些活性氧成分会导致细胞的死亡。因此，筛选出具有优良耐氧性的双歧杆菌，将极大地促进其在益生菌制品中的应用。

耐氧型双歧杆菌的获取一般需通过3步完成——分离、鉴定和驯化。首先是对各类样品进行处理，即在厌氧条件下培养、分离;然后通过鉴定手段以确定获取的菌株是否为双歧杆菌;最后使双歧杆菌菌株在厌氧环境和微需氧环境下交替培养，多次传代后即可获得耐氧型双歧杆菌。在此过程中，厌氧环境的形成和逐级氧气浓度梯度驯化(见图1)对耐氧型菌株的获取有非常重要的影响。DW-100A-K智能厌氧培养系统可精确、高效地实现氧气浓度从0~15%的梯度控制，并实现厌氧与微需氧环境的转化，从而增加耐氧型菌株阳性率。

3 益生菌制剂的生产工艺优化和工艺质控

在微生态理论指导下，采用已知的有益微生物，经培养、发酵、干燥等特殊工艺制成的生物制剂或活菌制剂被称为益生菌制剂。优质的微生态制剂应具备如下标准：

①活菌量应达到107~1010个/g;

②菌株应稳定、安全、可靠;

③菌株能在肠道内存活、繁殖，且具有抗环境变化的能力;

④制剂应能长期储存，且在有效期内不低于标示的活菌数。

以益生菌产品生产为例，生产过程主要由种子培养、投料接种、大罐发酵、菌液处理与冻干、益生菌产品的稳定性评价五大基本步骤组成。在此过程中，接种量、氧气浓度、培养温度是保证益生菌产品品质的重要影响因素，因此采用智能厌氧培养系统可精准实现各种微生物的生长环境，更好地确定加工流程与加工条件，确定产品加工过程中的质控点与要求，以保证产品品质。同时，该系统可同步实现在相同环境条件下的不同温度加速试验，从而更准确地对产品进行稳定性评价。

4 微生物培养组学(culturomics)研究领域

近年来，随着宏基因组技术的发展，人们对肠道菌群的菌群结构和功能的认识不断加深，但是对原核生物的纯培养却逐渐被忽视，而纯培养对于阐明这些微生物的功能和分离潜在益生菌而言是不可或缺的。因此，通过培养组学(culturomics)技术培养人体肠道菌群中从前无法培养的细菌受到科学界的广泛关注。培养组学使用多种培养条件促进较难培养的菌株生长，结合MALDI-TOF质谱和16S rRNA测序等技术，以鉴定细菌等微生物;通过利用培养组学，至少被分离一次的肠道物种增加了一倍。近年来，培养组学的应用不仅使可培养的人体细菌增加了几百种，其还能用于分离潜在的益生菌，是研究细菌疗法的基础。利用DW-100A-K智能厌氧培养系统的多种培养环境平行研究(同时生成：多种气体、多种浓度、多种温度可选;灵活：多种罐体，独立培养，避免交叉污染)的能力(如图2)，并结合多种培养基组合，将有助于提升培养组学技术平台的多重培养分离能力。

5 中药类保健食品成分的肠内生物转化研究领域

生物转化技术是指通过应用植物细胞、微生物或酶等生物体系对天然活性化合物进行合成与结构修饰的过程，进而起到增效减毒、产生活性成分等作用。该技术是开发中药及中药类保健食品的有效途径。

研究表明，在人和动物肠内菌丛中约99%是厌氧性细菌，利用微生物智能厌氧系统可模拟人肠内厌氧条件和菌丛组成，大量培养人体肠内厌氧性细菌，并将酶与保健食品中的中药类成分在37℃厌氧条件下共温培养，可实现生物转化过程。与此同时，通过建立相应的转化模型和标准操作规程，并结合转化产物与原形化合物的结构特点，还可推断转化机制，有利于寻找、合成有活性的天然产物及其衍生物，以对其进行深入的研究。

6 肠道微生物体外模型研究领域

在目前的研究过程中，建立合理且易操作的肠道微生物体外模型对推动肠道微生态学、人体和动物营养学的发展意义非凡。采用DW-100A-K智能厌氧培养系统，可根据胃、小肠、升结肠、横结肠等肠道部位的温度、氧气浓度、pH值等条件特点，在不同的独立培养罐中分别构建肠道微生物体外研究模型，因而更好地模拟肠道和研究外界因素(如益生菌、益生元等)对肠道微生物菌群的影响。同时，由于该系统提供精准的平行研究平台，最大程度保证了条件的一致性，通过连续发酵培养，将各模型进行整合，可帮助寻找出最佳的培养筛选条件，以实现对不同肠道段中微生物的靶向培养分离。